[发明专利]一种异源表达群体感应淬灭酶的方法有效
申请号: | 201710314231.3 | 申请日: | 2017-05-06 |
公开(公告)号: | CN107119066B | 公开(公告)日: | 2020-05-22 |
发明(设计)人: | 王岩;张晓华;李慧;杜良成 | 申请(专利权)人: | 中国海洋大学 |
主分类号: | C12N15/74 | 分类号: | C12N15/74;C12N1/21;C12N15/55;C12R1/01 |
代理公司: | 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 | 代理人: | 曾庆国 |
地址: | 266003 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 表达 群体 感应 淬灭酶 方法 | ||
本发明的目的是提供一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶的方法。本发明通过启动子的选择优化,利用高效恒定表达启动子PgroEL,实现了来自于海洋细菌耐油具柄菌的群体感应淬灭酶基因momL在陆生菌产酶溶杆菌中的异源表达,使构建的工程菌株具有抗菌及群体感应淬灭酶双重活性。并且,本发明将产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中的酮还原酶基因作为重组载体的整合位点,通过同源重组导致黄色素基因插入失活,而使菌落呈乳白色的方法,来筛选目标重组菌株,筛选效率大大提高。
技术领域
本发明属于有益微生物构建技术领域,具体涉及一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶的方法。
背景技术
产酶溶杆菌广泛生存于土壤和水环境中,能够分泌一系列胞外酶及具有抗植物真菌病原菌活性的次级代谢产物,是溶杆菌属中最具有生物防治潜力的一种革兰氏阴性菌。近年来,产酶溶杆菌作为一种新的生物防治剂被普遍用于防治由真菌引起的农作物病害,如产酶溶杆菌OH11对立枯丝核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌表现出较强的抑制活性,并且对番茄青枯病也具有很好的防治作用,其防治效果达86.4%(Borasr et al.1993);产酶溶杆菌3.1T8对坪草腐霉枯萎病菌具有拮抗作用,其产生的脂肪酶对腐霉根冠腐病存在抑制作用(Brederode et al.1991),此外,3.1T8也能够对立枯丝核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌、番茄枯萎菌、番茄叶霉菌、黄瓜褐斑病菌进行抑制(Folman et al.2003);产酶溶杆菌N4-7对由夏季斑枯病菌引起的草坪夏季斑枯病具有较好的生物防治作用(Kobayashi et al.1996);产酶溶杆菌C3可以用于防治由单孢锈菌引起的大豆锈病,平脐蠕孢菌引起的高羊茅叶斑并,并且它还可以通过几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶及HSAF等物质的抗真菌活性对小麦根腐病菌引起的离蠕孢叶枯病进行有效的防治(Zhang et al.1999,Zhang et al.2001,Palumbo et al.2005,Li et al.2008)。然而,上述实例均为产酶溶杆菌用于对植物病原真菌的抑制效果,而对植物细菌性病害的控制报道较少。为扩大产酶溶杆菌对植物致病菌的防治范围,可以构建具有新特性的产酶溶杆菌工程菌株用于植物细菌性病害的防治,MomL,一种群体感应淬灭酶,属于金属-β-内酰胺酶家族,与最相似蛋白为来自Bacillussp.240B1的AiiA,其同源性仅为24.5%,MomL具有明显的抑制病原菌致病因子及防病害能力,可作为生防蛋白进行改造利用。若将MomL在产酶溶杆菌中异源表达,则将赋予该菌更广谱的抑菌杀菌能力,但是产酶溶杆菌对多种抗性筛选使用的抗生素具有天然的抗性,增加了其遗传操作过程中转化子的筛选难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶MomL的方法,即借助所构建的带有特异性启动子的表达载体使群体感应淬灭酶MomL能够在产酶溶杆菌中稳定高效的表达;并且通过菌落黄-白颜色变化作为转化子的筛选标记,使其异源表达群体感应淬灭酶MomL,赋予产酶溶杆菌一种新的生防特性,利用构建的重组菌株产酶溶杆菌LeMomL对植物细菌性软腐病致病菌进行抑制,并应用于植物细菌性软腐病防治。
本发明首提供一种用于在产酶溶杆菌中表达群体感应淬灭酶MomL的表达载体,所述的表达载体,其中使用的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1;
作为优选,所述的重组表达载体,是将外源基因整合到产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中;
作为实施例的优选,是将外源基因整合到黄色素基因簇酮还原酶合成基因内部;
本发明另一个方面提供重组产酶溶杆菌,是用于重组表达群体感应淬灭酶MomL;
本发明再一个方面提供一种筛选重组产酶溶杆菌的方法,是通过颜色变化作为筛选标记来筛选工程菌株;
本发明提供的重组产酶溶杆菌菌株作为生物防治菌株的应用。
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