[发明专利]微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法

权利要求书

1.一种微载体悬浮培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3×10⁷个/ml；

(2)沉降微载体和细胞，以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，培养条件为：转速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、温度35～37℃，灌流速度为1～2个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5～3×10⁷个/ml；

(3)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、温度35.5～36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液；

(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得；

所述的低血清培养基的组成为包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％ (m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液；

所述的细胞维持液的组成为包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液；所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成；所述活性矿物酵母多肽ACB Bio-Chelate5是矿物元素与酵母多肽形成的络合物，具体为酵母多肽络合的锌、铜、镁、铁和硅，购自美国艾缇科技公司；

所述微载体的制备包括以下步骤：

取壳聚糖溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力搅拌制成浓度为10～15％(m/v)的壳聚糖溶胶液，加入1～4％(m/v)醋酸铵，搅拌均匀，加入聚羟基脂肪酸酯，超声处理25～30min，然后密封于高压蒸汽锅中，在250℃下处理3～4h，冷却至室温，离心取沉淀，用去离子水清洗2～3次，在60℃下真空干燥4～6h，得到表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，将得到的壳聚糖微球浸泡于1％(m/v)戊二醛溶液中，常温下反应2h，过滤，取沉淀，用去离子水反复清洗多次，真空40℃下干燥24h，即得壳聚糖微载体。

2.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO₂下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×10⁵个/mL的细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。

4.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的微载体为壳聚糖微载体，所述的微载体浓度为4～6g/L。

5.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯的加入量为壳聚糖的30～40％(m/m)。