[发明专利]一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

说明书

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体是一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，采用胰酶联合胶原酶及中性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁获得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。本发明建立了一套分离、培养及鉴定裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得可供科学研究的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞在低氧的生理情况下的功能变化提供了可能。

技术领域

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法。

背景技术

裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪亚目、滨鼠科、异头鼠亚科、裸鼹鼠属、裸鼹鼠种。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧、高二氧化碳浓度的环境。裸鼹鼠耐低氧的特性引起了科学家的广泛关注。骨骼肌是低氧研究的重要对象，骨骼肌作为运动器官，对于氧气浓度高度敏感。

从骨骼肌中分离获得的具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞(muscle satellite cells)在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletalmyoblasts，SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点。因此，成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。获得纯度较高的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞对于裸鼹鼠的耐低氧机制的研究是十分必要的。

相关分离培养方法尚未在裸鼹鼠中建立。现有的其他物种成肌细胞分离的方法中，消化步骤采用的胰酶和胶原蛋白酶浓度不是裸鼹鼠细胞分离最佳浓度。SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受损伤时，可被启动形成新的骨骼肌纤维。一般来讲，肌肉来源的动物越老，分离肌肉细胞所需要的时间越长，而且单个核前体细胞的产量也越低。

由此可见，裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞原代分离纯度不高，不利于通过该细胞对裸鼹鼠进行耐低氧等方面的研究，以至于国外尚未见裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞低氧方面研究的报道。为了研究裸鼹鼠骨骼肌在裸鼹鼠耐低氧等方面发挥的作用，分离纯化、体外培养出较纯度的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，采用胰酶联合胶原酶及中性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁获得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。

本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

A、将裸鼹鼠新生鼠骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次后，剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

B、加入每克肌肉1mL组织消化液，33-37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.05％-0.2％(W/V)中性蛋白酶，0.05％-0.2％(W/V)IV型胶原酶，0.1％-0.25％(W/V)I型胶原酶，0.08％-0.25％(W/V)胰酶，0.005％-0.02％(W/V)DnaseI；

C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

D、细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂环境中培养0.5-2h后，重复一次；所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗；