[发明专利]环孢霉素的偶联物及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种环孢霉素的偶联物，由环孢霉素半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。

2.如权利要求1所述的环孢霉素的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白。

3.如权利要求2所述的环孢霉素的偶联物，其结构通式如(I)

其中：n为与一个牛血清蛋白分子结合的环孢霉素的分子个数，所述n为整数1～20，cBSA为牛血清蛋白(Bovine serum albumin)，分子量范围6.6KDa～6.9Kda；

上述偶联物显示出如下物化特征：

(1)外观：白色粉末固体；

(2)紫外吸收光谱：250nm，277nm。

4.如权利要求3所述的环孢霉素的偶联物，其特征是：所述n为整数5～15，cBSA分子量范围6.6KDa～6.9Kda。

5.权利要求1～4中任一项所述的环孢霉素的偶联物的制备方法，其特征是：将环孢霉素与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。

6.如权利要求5所述的环孢霉素的偶联物的制备方法，由如下步骤完成：

(1)溶液A的制备：25mL圆底烧瓶中加入50mg环孢霉素(0.042mmol)，用10mL二 氯甲烷溶解。向其中加入14mg间氯过氧苯甲酸(MCPBA)，室温，搅拌过夜，之后加入碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，合并有机相，减压旋蒸，得到产物用稀盐酸水溶液溶解室温搅拌5h，之后调节pH至7，加入琥珀酸酐、羟基琥珀酰亚胺、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，以摩尔比1∶2～8∶5～15溶解在DMF-水两相混合溶剂中，反应生成环孢霉素类似物与乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺的活性中间体，为溶液A

(2)cBSA的制备：在0～4℃条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩尔比为15～25∶1∶15～25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20±5℃条件下搅拌反应2～4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，然后改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；

(3)溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；

(4)按环孢霉素与cBSA的摩尔比为15～50∶1量分别取溶液A和溶液B，在20℃±5℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4～6小时，得到溶液C；

(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，再改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；

(6)冻干上清液，得到白色环孢霉素的偶联物。

7.如权利要求6所述的环孢霉素的偶联物的制备方法，其特征是：步骤(1)所述的加入琥珀酸酐、羟基琥珀酰亚胺、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，以摩尔比1∶2～8∶5～15。

8.如权利要求6所述的环孢霉素的偶联物的制备方法，其特征是：步骤(2)所述乙二胺与 牛血清蛋白、EDC的摩尔比为20∶1∶20。

9.如权利要求6所述的环孢霉素的偶联物的制备方法，其特征是：步骤(4)所述环孢霉素与牛血清蛋白的摩尔比为30∶1。

10.权利要求1～4中任一项所述的环孢霉素的偶联物作为免疫原在制备环孢霉素特异反应抗体中的应用。