[发明专利]一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法。

背景技术

在家畜动物的生长及疾病防治中，转基因技术日趋成熟，为便于转基因细胞系的筛选及转基因动物的检测，在转入目的基因的同时，常常同时转入外源标记基因，而EGFP绿色荧光蛋白可以在荧光显微镜下直接观察，而常常作为一种标记基因；Neo基因是一种抗生素抗性基因，细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏G418，而常常作为一种筛选标记基因用于转基因单克隆细胞的筛选。因而这两种基因无可避免的会出现在转基因动物中，而转基因动物成功获得后这些标记基因便不再需要了。

同时，外源标记基因的存在将会对转基因家畜的健康将产生不良的影响，且我国转基因安全评价政策明文规定将标记基因等同于目的基因，同样必须经过复杂的安全评价，这无疑直接影响了转基因家畜的推广和产业化进程。因此，在进行转基因的操作中，通常在标记基因的两侧各加上一个相同的LoxP序列，以便在富集转基因成功的细胞后利用Cre/LoxP系统将转基因细胞内多余的标记基因删除。

猪圆环病毒，属于圆环病毒科，为单股环状DNA病毒，分为1型和2型。其中猪圆环病毒1型(PCV1)不致病，猪圆环病毒2型(PCV2)具有致病性。在养猪业疾病防控中，疫苗是人们用来对付疾病的最常用手段。而由于圆环病毒灭活疫苗与亚单位疫苗成本高、注射次数多和容易造成机体应激等缺点，以及免疫效力有待提高，并不能大规模的免疫接种。另外，疫苗的使用在控制由PCV2感染而引起PMWS中获得了一些成功，但是这种综合征的发病病源是多样的，且在其他综合征上并没有突破，所以通过转基因手段引入抗PCV2siRNA基因序列，使用RNA干扰技术对猪圆环病毒2型的防御显得更有实际价值。

在2013年12月25日公布的专利号为201310321355.6号，专利名称为“抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法”中公开了一种抗猪圆环病毒2型(PCV2)的表达载体和转基因猪及其构建方法，并通过该方法获得了F0代(原代)抗猪圆环病毒2型(PCV2)转基因猪，该转基因猪整合的外源基因包括目的基因抗PCV2siRNA的基因序列及标记基因Neo/EGFP融合表达基因序列，而标记基因的存在，将对该转基因猪产生不良的影响，并影响该转基因猪的安全评价，不利于该转基因猪的推广及产业化进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种无外源标记基因的抗PCV2的转基因猪制备方法，以解决上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其是通过如下步骤来实现的：

(1)、抗PCV2表达载体的构建，该载体包含目的基因抗PCV2的siRNA表达基因序列和标记基因序列；

(2)、筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，进行体细胞核移植获得F0代抗PCV2的转基因猪；

(4)、将获得的F0代抗PCV2的转基因猪与母猪杂交繁育获得能稳定遗传的抗PCV2的F1代转基因猪；

(5)、筛选F1代转基因猪个体并进行外源基因整合位点分析；

(6)、将筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并进行耳皮成纤维细胞系的建立；

(7)、建立删除了外源标记基因的细胞单克隆，并进行体细胞克隆获得F2代无外源标记基因的抗PCV2的转基因猪。

由此，通过上述方法获得的抗PCV2的转基因猪，可以特异表达抗PCV2siRNA，对猪圆环病毒疾病起到防疫作用；同时该转基因猪不含外源标记基因，不会对猪健康产生额外的负担及影响，同时也可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。

在一些实施方式中，上述外源标记基因是Neo/EGFP融合表达基因，Neo基因是一种抗生素抗性基因，细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏G418，而常常作为一种筛选标记基因用于转基因单克隆细胞的筛选；而EGFP为绿色荧光蛋白表达基因与目的基因共同转染构建转基因单克隆细胞系时，便于用显微镜直观的观察筛选结果，对转基因动物也可以通过观察绿色荧光蛋白的表达来初步判断转基因的结果，但EGFP绿色荧光蛋白在细胞水平表达会对细胞产生一定的毒性，在转基因猪个体中也会对猪的健康产生一定的影响，因此删除了Neo/EGFP融合表达外源标记基因的转基因猪会减少对该转基因健康的影响，同时可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。