[发明专利]一种U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的逆转录茎环引物组；

所述的逆转录茎环引物组包括以下三条特异性逆转录茎环引物：

引物stem-loop primer 21，其序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物stem-loopprimer 92a，其序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物stem-loop primer U6，其序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

所述的试剂盒还包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量检测引物组1和定量检测引物组2；

所述的定量检测引物组1包括以下4条定量检测引物：定量PCR上游引物m2102，其序列为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；定量PCR下游引物m2103，其序列为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；定量PCR上游引物U602，其序列为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；定量PCR下游引物U603，其序列为SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

所述的定量检测引物组2包括以下4条定量检测引物：定量PCR上游引物序列m9202，其序列为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；定量PCR上游引物序列m9203，其序列为SEQ ID NO：11所示核苷酸序列；定量PCR上游引物U602，其序列为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；定量PCR下游引物U603，其序列为SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

所述的试剂盒还包括：酶系、PCR反应试剂；

所述的酶系包括MMLV DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段；

所述的PCR反应试剂包括：pH 8.3～8.5的Tris-H₂SO₄，pH 7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸，柠檬酸钠，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dNTP；

所述的逆转录茎环引物组用于对U6、miR 92a及miR 21的单管三重逆转录；

所述的试剂盒还包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量检测探针组；

所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量检测探针组包括：定量检测探针组1和定量检测探针组2；

所述的定量检测探针组1包括以下2条定量检测探针：探针m2104：其序列为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针U604：其序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针m2104和探针U604的核苷酸序列的5’端标记有不同的荧光基团，所述的荧光基团分别选自FAM、HEX、VIC中的一种；探针m2104和探针U604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团，所述的猝灭基团为MGB；

所述的定量检测探针组2包括以下2条定量检测探针：探针m9204：其序列为SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针U604：其序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针m9204和探针U604的核苷酸序列的5’端标记有不同的荧光基团，所述的荧光基团分别选自FAM、HEX、VIC中的一种；探针m2104和探针U604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团，所述的猝灭基团为MGB；

所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量检测引物组和定量检测探针组用于实时荧光RT-qPCR技术，实现对miR 21和U6、miR 92a和U6的单管双重定量。

2.如权利要求1所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括定量标准品；

所述的定量标准品为：定量标准品1和/或定量标准品2；根据miRNA及茎环引物序列，分别合成miR 21质粒、miR 92a质粒和U6质粒；miR 21质粒含有如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列，miR 92a质粒含有如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，U6质粒含有如SEQ ID NO：15所示核苷酸序列；计算质粒拷贝数，U6、miR 92a和miR 21质粒分别稀释至E5、E4、E3、E2拷贝数/μl；将同浓度的U6、miR 21质粒混合，即得到同时含U6、miR 21质粒且U6、miR 21质粒浓度分别为5E4、5E3、5E2、5E拷贝数/μl的定量标准品1；将同浓度的U6、miR 92a质粒混合，即得到同时含U6、miR 92a质粒且U6、miR 92a质粒浓度分别为5E4、5E3、5E2、5E拷贝数/μl的定量标准品2。