[发明专利]一种耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及酶工程领域，具体公开了一种耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其编码基因与应用。本发明通过对玉米赤霉烯酮解毒酶的氨基酸序列进行优化，改变了解毒酶的8个氨基酸残基(与zlhy‑6解毒酶有8个氨基酸差异)，使重组表达玉米赤霉烯酮解毒酶最适反应pH由8.5降低到6.5，与猪、鸡肠道pH非常吻合，当pH低至5.0时，解毒酶酶活仍保留40％以上，大大提高该玉米赤霉烯酮解毒酶作为饲料添加剂在实际应用中的解毒效率。本发明还通过对玉米赤霉烯酮解毒酶基因进行密码子优化，并将该基因在重组酵母基因组中的拷贝数增加到4，大大提高了玉米赤霉烯酮解毒酶的表达量。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体地说，涉及一种耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶及其编码基因与应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，为2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，主要是由禾谷镰刀菌次级代谢产生的一种真菌毒素。ZEN具有雌激素活性，对生殖系统有毒害作用，摄入过量ZEN导致动物外阴和乳腺肿大甚至阴道及直肠脱垂；影响哺乳动物乳房发育，导致哺乳推迟、假孕，甚至不孕或导致流产，胎儿畸形和死胎。ZEN可以引发肿瘤，不仅通过增加细胞色素CYP1A1酶活性来刺激人类乳腺癌MCF-7细胞的生长，同时也是食管癌发病率增加的病因之一。ZEN对人和动物肾脏、肝脏和血液也具有明显的毒害作用。

ZEN的脱毒方法可以分为物理、化学和生物三大类，其中物理法有高压加热、辐照和吸附剂吸附等，化学法有臭氧、双氧水和碳酸钠处理等，生物法有微生物降解、微生物吸附和酶降解等。但传统的物理和化学脱毒方法会破坏营养物质、引入化学物质造成二次污染等问题，其应用受到一定的局限。生物降解法具有反应条件温和、专一性高、无残留、环境友好等优点，具有广阔的应用前景。

2002年，Kakeya分离到一株粉红粘帚霉(Clonostachys rosea IFO7063)菌株，能够破坏ZEN的内酯环，将ZEN完全转化为无任何雌激素活性的代谢产物，并确定由单拷贝基因zhd101所编码的碱性乳糖水解酶是降解ZEN的功能性蛋白质(Kakeya等，一株粉红粘帚霉将玉米赤霉烯酮转化无雌激素活性的化合物.生物科学、生物技术和生物化学杂志，2002)。Utermark和Karlovsky的插入失活实验证明了zhd101编码酶对ZEN的降解作用(Utermak和Karlovsky，玉米赤霉烯酮内酯水解酶在保护粉红粘帚霉免受玉米赤霉烯酮杀菌作用中的角色，应用与环境微生物学，2007)，Tomok等把zhd101转化到玉米中，发现玉米也表现出对ZEN的降解能力(Tomok等，通过降解基因来减少玉米籽粒中真菌毒素玉米赤霉烯酮的污染，应用与环境微生物，2007)。

中国发明专利ZL201110082679.X同样从粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)中克隆获得玉米赤霉烯酮解毒酶zlhy-6(与2002年Kakeya获得的zhd101编码酶只有4个氨基酸差异，蛋白同源性98％)及其编码基因。然而，该酶的最适pH为8.5，pH5.0和6.5时该酶的降解能力分别仅为pH8.5时的15％和25％，由此可见酸性条件严重抑制玉米赤霉烯酮解毒酶的活性；该解毒酶主要是作为添加剂混到猪、鸡饲料中，在猪、鸡体内降解玉米赤霉烯酮，而猪、鸡肠道pH值在5.5～6.5之间，因此亟需对玉米赤霉烯酮解毒酶进行耐酸改造，使其活性最适pH由8.5变为偏酸性。不仅如此，上述技术方案还将克隆获得的玉米赤霉烯酮解毒酶编码基因连接到质粒pPIC9K并转化毕赤酵母，获得能够表达玉米赤霉烯酮解毒酶的重组毕赤酵母菌株，但是玉米赤霉烯酮解毒酶的活性(表达量)很低，1mL重组酵母发酵上清液在2h时只可以降解18.8μg的ZEN。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的第一个目的是实现玉米赤霉烯酮解毒酶的耐酸性，扩大其解毒活性pH范围，本发明的第二个目的是实现该耐酸性玉米赤霉烯酮解毒酶的高效表达。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：