[发明专利]基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法

权利要求书

1.一种基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；

将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用秋水仙素处理，受体原生质体用紫外光照强度下照射处理，然后用利用PEG高ca²⁺-高pH值法诱导进行原生质体融合；

融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。

2.如权利要求1所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法具体包括以下步骤：

步骤一，原生质体制备：在红掌幼苗生长中，将幼嫩叶片或根尖经消毒后，接种到培养基上培养形成愈伤组织，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体备用；

步骤二，供体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体悬浮液的密度，在紫外光照强度下照射，得到供体原生质体；

步骤三，受体原生质体制备：取步骤一获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体悬浮液的密度，然后加入秋水仙素处理，在摇床上振荡，培养得到受体原生质体；

步骤四，体细胞杂交：取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体,按体积比混合，得亲本悬浮液，加入亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，再加入亲本悬浮液体积的高ca²⁺-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗涤，离心得到融合的杂种细胞；

步骤五，杂种细胞培养：取步骤四融合细胞转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养获得完整的体细胞杂种植株。

3.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤一中，所述在红掌幼苗生长中，选用生长快、花色好、品质优的红掌优良单株幼苗。

4.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤二中，原生质体悬浮液密度为0.5×l0⁵个/mL～l×l0⁵个/mL，在1000μW/cm²～1500μW/cm²紫外光照强度下照射5min～25min。

5.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，步骤三中，原生质体悬浮液密度为0.5×l0⁵个/mL～l×l0⁵个/mL；加入0.15g/L～0.50g/L秋水仙素处理，在转速为80r/min～120r/min的摇床上振荡培养3d～15d。

6.如权利要求2所述的基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：所述取步骤二供体原生质体和步骤三受体原生质体，按按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1倍～4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液；在25℃～32℃下保温15min～30min，再加入2倍～4倍亲本悬浮液体积的高ca²⁺-高pH溶液，混合后在25℃～32℃下保温10min～15min，然后使用CPW溶液洗涤2遍～3遍，离心得到融合的杂种细胞。

7.一种利用权利要求1所述基于原生质体不对称融合技术的红掌体细胞杂交育种方法构建的红掌细胞融合杂交育种体系。