[发明专利]一种玉米自交系茎尖活体转化方法

说明书

本发明属于作物遗传育种领域，涉及一种玉米自交系SL1303茎尖活体转化方法，该方法是以玉米自交系SL1303为受体材料进行农杆菌介导的茎尖活体转化转入外源基因，获得转基因玉米。该方法与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，而且当代即可获得转基因的种子，T₂代可获得纯合的转基因株系，无需组培再生阶段，对于保持主栽品种的生产力而改善其某一性状具有特殊的优势，有望发展为玉米转基因的常规技术，在提高玉米的品质性状和抗逆性能等方面的品种改良中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种玉米自交系茎尖活体转化方法。我们将玉米PIFs基因在玉米自交系SL1303中进行农杆菌介导的茎尖活体转化，将含有除草剂筛选标记的外源基因ZmPIF1和ZmPIF3转入到玉米茎尖，通过除草剂草丁膦筛选获得了阳性植株，并进行PCR检测，通过正交实验对转化条件进行综合研究，创建了适合玉米自交系SL1303农杆菌介导的茎尖活体转化的最优方案。农杆菌介导的茎尖活体转化与传统的农杆菌介导转基因方法相比，具有许多不可比拟的优势：成本低，操作简便，不受季节、植物发育时期等因素的限制，有望发展为玉米转基因的常规技术，为今后利用该方法进行玉米的转基因提供坚实的基础。

背景技术

1植物转基因的方法

植物转基因是利用重组DNA技术将克隆到的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而获得具新性状的植物。这一技术绕过了物种生殖隔离的障碍，使基因交流的范围扩大到整个生物界，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物甚至人工合成的基因导入植物(魏松红等，2002)。自1984年，世界第一例转基因植物——烟草问世以来，转基因植物产生至今仅20多年时间，其研究和应用得到了非常迅猛的发展，常规的植物转基因方法已日趋成熟。大体可分为物理诱导DNA直接插入法、化学诱导DNA直接插入法以及载体转化法三种转化方法。

1.1物理诱导DNA直接插入法

物理诱导DNA直接插入法包括电激法、超声波介导法、子房注射法、花粉管通道法和基因枪法等。1986年Fromm等人首次成功用电激法转化了玉米原生质体(Fromm et al.,1986)。张宏等人利用超声波法转化玉米愈伤组织获得转基因植株(张宏等，1997)。1993年丁群星等用子房注射法把Bt基因导入玉米，成功获得了转基因植株(丁群星等，1993)。

基因枪法是植物遗传转化比较常用的方法之一，基因枪法由美国Cornell大学的Sanford等研究提出(Sanford et al.,1987)。其原理是通过亚精胺、CaCl₂等试剂将DNA包被在重金属颗粒(如钨粉、金粉等)上制成微弹，利用基因枪产生的高压冲力将携带外源目的基因的微弹直接导入受体细胞，外源基因随机整合到植物染色体中，从而实现外源基因在被转化植物中的表达和稳定遗传(李宝山，2008)。1987年,Klein等首次将基因枪法应用于植物转基因研究，并于1989年第一次使用基因枪法转化玉米获得成功(Klein et al.,1989)。

1.2化学诱导DNA直接插入法

化学诱导DNA直接插入法主要包括PEG介导法和脂质体介导法。PEG介导法主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L‐鸟氨酸、磷酸钙及存在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子(刘俊等，2005)。PEG介导法目前在玉米中得到了应用(Liang et al.,2014)。脂质体介导法是通过植物原生质体的吞噬或与细胞膜的融合作用把被脂质体包装成球状的外源DNA转入受体细胞中。脂质体介导法一般应用动物细胞转化，植物细胞转化的应用还比较少。王瓞等人利用烟草研究过脂质体介导基因转染的最优条件(王瓞等，1997)。脂质体介导法和PEG法都是以植物的原生质体为受体材料，因此这两种方法对于原生质体再生困难的植物来说，受到了一定的限制。

1.3载体转化法