[发明专利]一种季鏻化壳聚糖及其作为疫苗免疫佐剂的应用

说明书

本发明公开了一种季鏻化壳聚糖及其作为疫苗免疫佐剂的应用，该季鏻化壳聚糖的制备方法包括以下步骤：将壳聚糖和1‑羟基苯并三唑加入到溶剂中，冰浴反应，然后调节pH值至4.8‑5.5；再加入3‑羧丙基三苯基溴化磷，搅拌至完全溶解；将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于溶剂中，加入到上述反应体系中，反应后将产物沉淀，干燥，透析，冷冻干燥后得到季鏻化壳聚糖。本发明首次采用季鏻化壳聚糖作为免疫佐剂，季鏻化壳聚糖能促进DC2.4细胞对抗原的摄取，促进脾细胞增殖，诱导更高水平的抗原特异性IgG抗体效价、IFN‑γ、IL‑4和IL‑10，因此在疫苗治疗领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种季鏻化壳聚糖及其作为疫苗免疫佐剂的应用。

背景技术

疫苗接种是公认的近现代人类医学发展史上最重大的发明之一，至今仍然是人类预防、抵御和控制传染性疾病的最有效方法，例如流感、肝炎、肺结核等。

起初的疫苗由完全病原体或其裂解液制成，免疫原性好，但是会导致不良症状和感染。因此，一些更安全的疫苗正在研究和开发，包括DNA、亚单位和重组疫苗。然而这些新型的疫苗仍具有免疫原性较低、免疫应答诱导较弱、靶向性弱等缺点。因此，探索和研发用以增强疫苗功效的技术具有重大意义，设计有助于提高免疫原性、改善安全性、增强机体特异性免疫应答的免疫佐剂成为首要任务。

自1925年起，免疫佐剂(Immunoadjuvant)便引起了研究者们的广泛关注和浓厚兴趣。免疫佐剂是一类能帮助递送抗原、活化抗原递呈细胞(APC)并引发机体免疫细胞的活化与分化的非特异性免疫刺激分子。

理想的免疫佐剂必须具备以下特征：1.安全性好；2.增强弱免疫原性疫苗的免疫原性；3.增进免疫接触，增强机体的免疫应答；4.减少抗原接种剂量和接种次数；5.加快免疫应答的速度和延长持续时间等等。

常见的免疫佐剂有铝佐剂和弗氏佐剂两种。铝佐剂是第一种FDA批准用于临床治疗的人用佐剂，但其诱导细胞免疫能力较弱，且会引发局部炎症。而弗氏佐剂主要应用为动物疫苗佐剂，毒副作用较大。因此研究开发新型、安全并且能有效诱导细胞和体液免疫的免疫佐剂具有重大的意义。

壳聚糖及其衍生物由于具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性、免疫刺激活性、缓释控释、靶向性等优点，近年来已成为世界范围内免疫佐剂的研究热点。然而，壳聚糖的水溶性较差，只溶于稀酸，这严重限制了其在生物医药领域的应用。

发明内容

为了克服现有的壳聚糖及其衍生物水溶性差的问题，本发明的首要目的在于提供一种季鏻化壳聚糖，采用酰胺反应合成，其水溶性良好，能溶于水和生理盐水中。

为了克服现有的免疫佐剂诱导细胞免疫能力较弱和毒副作用较大的缺陷，本发明的另一目的在于提供上述的季鏻化壳聚糖作为疫苗免疫佐剂的应用，季鏻化壳聚糖作为疫苗免疫佐剂可以提高机体特异性免疫应答。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种季鏻化壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖(CS)和1-羟基苯并三唑(HOBt)加入到水/二甲基亚砜混合液中，冰浴条件下搅拌2-3h，然后调节混合物的pH值至4.8-5.5；再加入3-羧丙基三苯基溴化磷(CTPB)，搅拌至完全溶解；

(2)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于水/二甲基亚砜混合液中，然后加入到步骤(1)的反应体系中，反应1-2天，产物用丙酮/乙醚混合液进行沉淀，再将沉淀产物真空干燥1-2天后溶于超纯水中，并于超纯水中透析3-4天，冷冻干燥后得到季鏻化壳聚糖(NPCS)；

上述步骤中，壳聚糖的糖单元、HOBt、CTPB、EDC·HCl四者的摩尔比为1:2:1:2；