[发明专利]一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法

说明书

本发明公开了一种快速驯化贴壁细胞成为全悬浮细胞系的方法，将低传代健康贴壁细胞直接接种到无血清、无微载体培养基的转瓶中驯化培养；当细胞适应了大于6rpm转瓶机的转速，转到摇瓶中，用新鲜培养基将细胞起始密度调整至5x10⁵细胞/mL，摇瓶转速调整为10‑40rpm；如果4‑5天后细胞密度增长达不到1x10⁶细胞/mL，将细胞离心沉淀后用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞密度调整在5x10⁵细胞/mL后继续驯化培养，反复这一驯化步骤直到细胞密度在4‑6天后≥10倍增长，经过10代以上摇瓶传代驯化培养，即可获得全悬浮细胞系，该方法简便，快速，重复性好，成功率高，全悬浮细胞系稳定并且对病毒的感染性不变。

技术领域

本发明涉及一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法。

背景技术

将贴壁细胞驯化成为全悬浮细胞是国内外研究和大规模生产治疗性蛋白质和疫苗发展的趋势。大多数脊椎动物细胞是贴壁细胞。在生产中常常使用这种贴壁细胞（Wurm等人，2004）。然而，使用贴壁细胞时，常会遇到一些困难，例如，（1）为了让细胞能够附着，必须使用如瓶和微载体等以形成细胞单层。大量生产时就必需选用更大的培养容器或反应器。（2）在培养贴壁细胞时，培养基中须加入一定量的牛血清，为细胞提供生长因子和满足细胞贴壁需求的各种营养物质。但是，牛血清存在批间差，且质量不稳定，同时生产成本也会增加，另外，为清除终产品中血清蛋白含量而增加了生产下游的工作量和污染的机会（Fortis等人，2006）。（3）为了细胞传代常要使用胰蛋白酶消化细胞单层，这个程序也会增加产品的成本和污染的机会。综上所述，目前急需一种经济，简便，安全和低成本的细胞生产工艺（Buffer 2015）。

许多细胞系容易适应无血清培养基环境，而有些细胞是很难适应这样的培养条件，因此，重要的是需要有更好的方法让细胞适应这种无血清培养基和全悬浮培养。

国内外也已有一些关于驯化方法方面的报道。可以查到已发表的贴壁细胞驯化方法是直接法和渐进法，直接法是直接在无血清或不含血清培养中驯化某些贴壁细胞的方法，但是到目前为止，未见有用直接法成功驯化贴壁细胞的报导，因此许多人建议不使用这种方法；渐进法是比较常用的方法，即将贴壁细胞培养在血清浓度递减的培养基里，直至过渡到无血清的悬浮培养，经过若干代驯化后，最终获得全悬浮细胞系，这种渐进驯化法费时、费力和费材料而且成功率低。

我们认为除驯化方法十分重要外，对于培养基的选择也很关键，往往决定细胞驯化的成败。

发明内容

本发明提供了一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法，该方法类似于直接法，其特点是简便，快速，重复性好，成功率高，全悬浮细胞系稳定并且对病毒的感染性不变。

本发明所采用的技术方案是这样的，一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法，具体包括如下步骤：

1）将低传代健康贴壁细胞直接接种到无血清、无微载体培养基的转瓶中驯化培养；

2）当细胞适应了大于6rpm转瓶机的转速，即细胞密度增长达到1x106细胞/mL后，将细胞转到摇瓶中，用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞起始密度调整至5x10⁵细胞/mL、摇瓶转速调整为10-40rpm；

3）如果4-5天后细胞密度增长达不到1x10⁶细胞/mL，将细胞离心沉淀后用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞密度调整在5x10⁵ 细胞/mL后继续驯化培养，反复这一驯化步骤直到细胞密度在4-6天后≥10倍增长，即可完成驯化培养；

4）按照上述驯化培养，经过10代以上摇瓶传代驯化培养后，即可获得稳定的全悬浮细胞系。