[发明专利]一种携载抗肿瘤药物连接CD22单抗靶向淋巴瘤的血小板靶向载药体系的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物药物载体制备领域，尤其涉及一种以连接CD22单抗靶向淋巴瘤细胞的血小板作为靶向药物载体携载抗肿瘤药物的制备方法。

背景技术

恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴组织的恶性肿瘤，按病理和临床特点可分为两大类：霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，后者占90％以上。NHL发病率近年来急剧增加，其中，B细胞淋巴瘤是与恶性B细胞单克隆扩增相关的一组异质性肿瘤，约占成人NHL的85％。高度异质性血液恶性肿瘤的B细胞淋巴瘤表现出不同的临床和生物学特征。尽管治疗反应有所进展，但高水平B细胞NHL的5年生存率低于50％，化疗依然是B细胞淋巴瘤的一线治疗。但是化疗具有明显的副作用，包括骨髓抑制、免疫功能低下、消化道反应等，提高药物的靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前淋巴瘤诊治的挑战，所以研究和开发能将抗淋巴瘤药物靶向传递到肿瘤细胞内部或周围以期较少副反应的药物载体具有十分重要的意义。

目前而言，药物载体主要包括磁性纳米药物载体、脂质体载体、微粒载体等，但它们均存在诸多缺点，如载药率不高，稳定性较差，毒性作用较强等，因而生物药物载体凭借其良好的生物相容性、缓控释药等特点在众多载药体系中脱颖而出。

以生物作为药物载体的研究已进行了很多年，研究较为深入的包括白蛋白载药和红细胞载药等。临床上应用成功的典型范例是以人血清白蛋白为载体的紫杉醇产品，研究显示其可在肿瘤细胞和组织中蓄积，可用于治疗乳腺癌、卵巢癌等。另外的研究显示，经红细胞包载后释放的甲氨蝶呤和长春新碱等药物，抑制肿瘤生长及诱导其凋亡的效果较裸药更为显著。

血小板是从骨髓成熟的巨核细胞脱落下来的碎片，直径约2um，在成人血液中数量约为(1-3)×10¹¹个/L，其寿命约7-14天，平均9天，衰老的血小板大多被肝脏中的Kupfer细胞清除，因而血小板具有良好的生物相容性、安全性及较长的血循环时间。血小板在止血、愈合伤口、血栓形成等过程中起着重要作用，并且与肿瘤的发生发展也具有密切的关系。肿瘤细胞经过一系列反应活化血小板，活化的血小板通过肿瘤细胞诱导的血小板聚集(TCIPA)作用聚集在肿瘤细胞周围，形成血小板-肿瘤细胞复合物，正是这种作用促进了血小板与肿瘤细胞的粘附，并且活化后的血小板将摄取的药物释放，而血小板摄取药物及小颗粒的作用与巨噬系统的吞噬作用不同，即不会将内吞的物质杀死和清除，从而保证了药物原有的结构和活性，保留了药效。另外研究显示，血小板的载药率远高于纳米颗粒的载药率，且血小板与细胞毒药物具有协同作用，可以增加其杀伤作用。

然而血小板的特异性和精确靶向的挑战限制了它们作为药物载体的功效。相比之下，单克隆抗体(mAb)是高度特异性和精确的靶向系统。结合了药物的肿瘤特异性抗体可以将药物引导到肿瘤细胞，证明其可能用于靶向药物递送。由于90％以上的B细胞淋巴瘤细胞上有CD22抗原表达，且CD22抗原的表达率为80％-100％，远高于正常成熟B淋巴细胞，并且结合CD22的抗体可以被迅速内化，CD22作为化学免疫偶联物也因此引起了特别注意，被用于将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤细胞。

因此，在这项工作中，我们建议使用连接CD22单抗的血小板作为治疗B细胞淋巴瘤的新型药物靶向递送系统，其具有含量丰富、生物相容性好、载药率高、主动靶向性好、对肿瘤细胞疗效高而对正常组织损害小的优势，这方面目前还没有相关的研究报导。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以连接CD22单抗的血小板作为药物载体包载抗肿瘤药物的制备方法，制成携载抗肿瘤药物连接CD22单抗的血小板靶向载药体系，具有生物相容性好、载药率高、主动靶向性强、在肿瘤组织的酸性环境中释放率高，从而增加药物的抗肿瘤活性等优点。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种携载抗肿瘤药物连接CD22单抗靶向淋巴瘤的血小板靶向载药体系的制备方法，包括以下步骤：

(1)环境温度为20±5℃，在全血中加入重量百分含量为2-4％柠檬酸钠溶液，离心后得到血小板丰富血浆；

(2)将步骤(1)得到的血小板丰富血浆再深度离心，并用PBS缓冲液洗涤至不再含有血浆及其他血液成分，得到洗涤血小板；

(3)将步骤(2)得到的洗涤血小板与3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂(MBS)试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，离心洗涤，得到表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板。