[发明专利]影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法。

背景技术

猪肉质性状是动物经济蛋白生产的重要指标。尽管目前已经进行了大量针对猪肉质性状的遗传机制的研究，但全基因组水平探索候选基因和遗传机制的研究还是相对有限。过去20年DNA测序技术快速发展，目前已经成为研究遗传机制的重要手段。大量的研究表明转录因子、生长因子受体和信号通路机制参与肉品质性状形成的调节过程。

DNA甲基化是最早发现的基因表观遗传修饰之一，先前的报道表明，甲基化的CpG双核苷酸通过改变染色质结构或影响一些转录因子的结合活性抑制基因的表达。同时DNA甲基化调节不同的生理进程，包括胚胎发育、x染色体失活、细胞分化和抑制印迹基因的表达。DNA甲基化几乎只发生在5'碳胞嘧啶的位置^[8]。然而这些CpG点在基因组中所占比例仅为1％。远低于其他二核苷酸序列的出现频率^[9]。70％～80％的CpG双核苷酸处于DNA甲基化状态。但是存在一些区域，非甲基化的CpG不是均匀分布，而且呈现局部聚集倾向，是胞嘧啶和鸟嘌呤的富集区，CpG双核苷酸序列密度很高，以大小为300-3000bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛的形式存在，出现频率为平均值的5倍，形成CpG岛，CpG岛一般处于非甲基化状态。2012年Li等利用MeDIP-Seq方法绘制了猪基因组甲基化图谱，探索了全基因组不同表型的脂肪组织中脂肪沉积和DNA甲基化之间的关系。2015年Choi等利用RRBS方法对猪五个不同组织和一个细胞系进行全基因组DNA甲基化测序，观察表明猪全基因组甲基化图谱和人类等哺乳动物有着很高的相似度，CpG甲基化比例和基因的功能在五个组织中(除细胞系)正相关。试验为猪表观遗传学的探索提供重要的信息。2006年张等通过基因芯片分析拟南芥全基因组甲基化，表明DNA甲基化不仅作用于启动子和增强子还在基因间区和基因区扮演着重 要角色。也有学者认为，并不是所有的基因都有相同的甲基化和基因表达模式。有研究表明，启动子区CGI的缺失是DNA甲基化抑制的miRNA的一个共同特点。

随着对遗传学和表观遗传学的深入了解，我们致力于筛选候选基因。选取肉质性状差异大的两个极端猪种，皖南花猪(脂肪型)和大约克猪(瘦肉型)，是研究猪生长性能和肉质差异化的理想模型。我们的研究的目的是分析比较皖南花猪和大约克猪全基因组DNA甲基化模式，识别筛选可能参与脂肪酸代谢和脂肪沉积过程的关键基因。利用MeDIP-seq方法探索DNA甲基化和两个品种猪种肉质差异的联系。得到全基因组水平下高甲基化和低甲基化Peaks和DMRs在基因特征区域和CGI的数量和分布。除此之外，筛选出GO功能注释和KEGG Pathway通路分析中与脂肪酸代谢和脂肪沉积相关的条目和通路，做出相关的功能和途径分析。同时结合转录组测序，进行DNA甲基化和转录组表达谱的联合分析，筛选出同时差异甲基化和差异表达的基因。最后随机挑选7个候选基因进行焦磷酸测序，验证DNA甲基化免疫共沉淀的准确性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种影响猪肉质性状的功能候选基因。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种影响猪肉质性状的功能候选基因的筛选方法。

对于影响猪肉质性状的功能候选基因，本发明采用的技术方案是，功能候选基因是RXRG、GPI、CPT2和/或GABARAPL1。

其中的RXRG、GPI、CPT2和GABARAPL1的核苷酸参考序列，已经通过国际猪基因组测序联盟(International Swine Genome Sequencing Consortium)公布的猪全基因组序列发布。

对于筛选方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)选取肉质性状差异大的两个极端猪种的背最长肌，提取DNA，独立建库；

(2)采用高通量的全基因组DNA甲基化免疫共沉淀测序技术对样本DNA库进行全基因组DNA甲基化测序；

(3)获得两个极端猪种的全基因组DNA甲基化水平的图谱，并筛选到差异甲基化基因；

(4)对差异甲基化基因进行GO功能注释和KEGG Pathway分析，筛选出与脂肪酸生成和分解等肉质性状相关的功能基因和调控通路；

(5)结合MeDIP-seq和RNA-seq的试验结果，进行DNA甲基化和表达谱的联合分析，获得猪肉质性状的功能候选基因。