[发明专利]一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体及制备方法

说明书

一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体及制备方法，属于材料、生物和分析化学交叉学科的技术领域,其特征在于该超分子组装体是由季铵型阳离子双子表面活性剂与肝素钠通过静电作用形成的复合物水溶液。制备方法是首先测定双子表面活性剂的临界胶束浓度，在该浓度下双子表面活性剂与肝素钠形成超分子组装体，疏水染料尼罗红进入组装体内腔，荧光发射增强。然后加入与肝素钠有特异性相互作用的鱼精蛋白解组装，荧光发射强度随鱼精蛋白浓度的增加而降低。再加入胰蛋白酶使鱼精蛋白水解，组装体恢复，荧光发射强度随酶浓度增加而升高，实现酶活性的检测。本发明组装体制备简单、成本低，具有良好的抗盐性和广泛的应用前景。

技术领域

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体及制备方法，属于材料、生物和分析化学交叉学科的技术领域。

背景技术

胰蛋白酶是蛋白质分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循环的不平衡会导致急性或慢性的胰腺疾病，严重的例如胰腺癌。大约每年有35000例胰腺癌是由于丝氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。

目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、质谱法(MS)、液相色谱法(HPLC)、电泳法等。紫外分光光度法与比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。质谱仪器昂贵，对样品的纯度要求高，色谱以及电泳法需要比较复杂的操作和较长的检测时间。

相比这些方法，荧光法操作简便、灵敏度高、可实现实时监测，具有临床应用的潜在可能。一般荧光检测的方法是基于荧光标记的底物，如专利201410429549.2采用了荧光团标记的肽链，但这种方法成本较高而且荧光标记可能会对底物的选择性造成一定的影响。因而有研究者发展了基于非共价作用即超分子组装的无标记荧光检测方法，组装单元主要是应用水溶性荧光共轭聚合物以及新型的聚集诱导发光分子或者荧光量子点，如专利201510719927.5采用了荧光碳点作为探针，但这些荧光探针的合成与分离仍然比较复杂，提高了成本。因而建立制备简单、成本低的荧光检测方法具有重要的意义。

我们以前开发了一种无标记的胰蛋白酶检测方法，如专利201210116073.8所述，采用表面活性剂与带相反电荷的聚电解质进行组装，通过酶催化水解作用下的解组装来实现胰蛋白酶的检测。该体系是通过荧光减低来实现检测，相对于荧光升高的方法，荧光降低的干扰因素较多，此外该体系的抗盐性较差，限制了该体系在生理环境中的应用。因而本发明中采用抗盐性较好的双子表面活性剂来构建超分子组装体，并通过荧光升高的方式来实现检测。通过检索，未见双子表面活性剂用于荧光检测的专利与报道。

发明内容

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体及制备方法的目的是克服现有技术的不足，提供一种制备简单、成本低且具有良好抗盐性的无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体及其制备方法。

本发明一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体，其特征在于该超分子组装体是由季铵型阳离子双子表面活性剂与肝素钠通过静电作用形成的复合物水溶液，所述的季铵型阳离子双子表面活性剂化学结构式为：

其中n＝12，14，16。

上述一种无标记荧光检测胰蛋白酶的超分子组装体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

Ⅰ季铵型阳离子双子表面活性剂的临界胶束浓度CMC的测定；