[发明专利]一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用

说明书

本发明属于基因工程抗体技术及细胞生物学技术领域，具体涉及一种脑部靶向转铁蛋白受体（TfR）的单链抗体。体外实验证明本发明所述靶向转铁蛋白受体的单链抗体可特异性与转铁蛋白受体相结合，可作为诊断、治疗中枢神经系统疾病的小分子运载体，应用于偶联脑部治疗性药物，通过转包吞作用将药物或诊断剂转运至脑部，对中枢神经系统疾病药物的开发和研究具有十分重要的价值。

技术领域

本发明属于基因工程、细胞生物学技术领域，具体涉及一种可与人脑内皮细胞上转铁蛋白受体高特异性结合的脑部靶向单链抗体，具有特异性将药物运输至脑部的作用，是一种可用于人类神经系统疾病治疗的基因工程抗体。

背景技术

中枢神经系统（CNS）紊乱性疾病已经在全球范围内影响了超过10亿人的健康，已超过了心脑血管疾病及癌症对人类的影响，其治疗负担已占据了全球公共健康负担的13%。由于血脑屏障（BBB）的存在使得药物无法进入到脑内发挥作用，而这正是影响中枢神经系统疾病治疗效果的最主要原因。血脑屏障由血管内皮细胞，周细胞，星形胶质细胞，神经元等神经血管单元（NVU）组成，与其他组织器官相比，脑毛细血管内皮细胞的紧密连接，胞饮作用的减弱极大的限制了药物通过血液进入脑组织，且循环系统中的抗体仅约有0.1-0.2%可以以稳定的浓度进入到脑内。血脑屏障不仅限制抗体，免疫介质，免疫细胞的渗透，同时其自身也缺乏淋巴管及树突状细胞，因此一旦患病，脑内无法立即做出有效的免疫应答。

近些年中，针对如何使药物进入血脑屏障已投入了大量研究，但一些试图增加血脑屏障渗透性或化学扰乱方法的效果不理想，利用血脑屏障自身的转运系统才是最安全的选择，血脑屏障上的转运方式可以分为三种1）载体介导的转运（CMT），2）主动外排机制（AET），3）受体介导的转包吞作用（RMT），其中前两种均为血液和脑组织之间运输如葡萄糖，氨基酸等小分子物质的途径，而第三种则是通过与脑内腔表面特定受体结合通过转胞吞作用来转运大分子，如胰岛素，转铁蛋白（TfR）等。在这些受体中，转铁蛋白受体是最值得关注及研究的受体，它高表达于脑内皮细胞，主要通过内吞作用摄取与转铁蛋白结合的铁离子来维持脑内铁离子的稳定，而此靶点较为重要的一点是，抗体与转铁蛋白受体结合的表位与转铁蛋白不同，因此并不影响转铁蛋白对铁的转运。

目前没有脑部靶向抗体获FDA批准上市，因此脑部靶向TfR抗体有巨大的开发潜力成为治疗脑部疾病的功能性抗体。脑部靶向TfR抗体通过与脑内皮细胞上受体相应靶点结合，在不破坏脑部组织完整性的前提下通过受体介导的转包吞作用将抗体转运至脑内发挥作用。有研究表明非靶向性抗体在脑内的含量并不受神经病理影响，即中枢神经系统疾病进程的增加并不会引起血脑屏障的损伤及渗漏，因此非靶向性治疗抗体通过渗透进入脑内的含量也不会增加，但无论患病与否，TfR受体在血脑屏障中含量保持不变，由此看来，靶向TfR抗体具有巨大的研究前景及价值，也是研究药物传递和中枢神经系统疾病的重中之重。

抗体药物的研究趋势要求抗体可实现靶向性强，分子量小等特点。其中单链抗体是由一条连接肽（linker）将重链可变区VH和轻链可变区VL首尾相连形成具有抗原结合功能的最小功能结构单位，相比于全抗来讲，具有分子量小，免疫原性低等特点。在体外研究中，抗TfR全抗已证实具有细胞毒性，且抗体化合价越高，毒性越大，如五价IgM，二价IgA 等细胞毒性均大于IgG，且当将IgG改型为仅保留其Fab段抗体分子时，未检测出抗TfR抗体具有细胞毒性，同时不会引起受体内化而干扰转铁蛋白的转运。因此小分子抗TfR抗体具有非常大的临床前研究价值，抗TfR单链抗体由于分子量只有全长抗体的1/6，因此可以作为小分子基因工程抗体，与放射性同位素，细胞因子等效应分子构建成多种双功能性抗体，同时作为转运工具，与前体药物，神经营养因子相连，靶向脑部用于治疗CNS疾病。因此与完整的单克隆抗体相比，单链抗体既可以发挥与脑部受体高特异性的结合活性，又可利用其转运优势发挥其生物学活性，在脑部靶向治疗方面显示出巨大潜力。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有潜在医学和药学价值的脑部靶向转铁蛋白受体（TfR）的单链抗体及其应用。本发明单链抗体的特征为具有在体外特异性结合人脑部TfR并可作为运载工具的小分子基因工程抗体。