[发明专利]利用单拷贝核基因检测食品和饲料中山羊源性成分的实时荧光PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种利用单拷贝核基因检测食品和饲料中山羊源性成分的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有山羊源性成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增山羊源性成分的特异性引物对和山羊源性成分的特异性探针。本发明的山羊源性成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品和饲料中是否含有山羊源性成分提供了一种定量检测方法，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用单拷贝核基因检测食品和饲料中山羊源性成分的实时荧光PCR检测方法。

背景技术

由于山羊肉与绵羊肉的区分一直存在很大的困难，因此在很多的食品与饲料的检测当中通常不去区分山羊和绵羊，只检测是否含有羊成分，这在无形当中对食品安全埋下了隐患，也使得一些不法分子进行掺假牟利有了可乘之机。2013年初，瑞典、英国等多个欧洲国家卷入“马肉风波”丑闻中，引起各国对肉及肉制品掺假问题的关注。

在我国，“掺假”问题一直是消费者投诉的焦点和社会关注的热点。一些不法商贩和企业因利益驱使，将猪、鸭等低成本原料掺入牛、羊等高价肉及肉制品中。这些行为不仅侵害消费者利益，还可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起纠纷，如果未经检疫还有可能引起疫病的传播，不利于维护社会安定和人民身体健康，如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。为了打击肉类掺假的违法行为，维护消费者权益和生命安全，保障食品产业的健康发展，制定严格的法律法规来约束生产者和经营者的行为是极为重要的，同时也需要制订准确、灵敏、简便的检测方法。

常见的肉及肉制品真伪鉴别技术主要包括：(1)基于蛋白质分子结构的免疫分析技术等；基于蛋白大分子结构的免疫分析方法具有高灵敏度、高通量、操作简便的特点，可实现对大量样品的快速检测。例如，Macedo-Silva等通过制备抗牛、鸡、猪、马白蛋白的抗血清建立了ELISA方法用于鉴别汉堡中可能掺入的廉价肉类成分，灵敏度可达0.6％。但是，基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析方法对于亲缘关系较近的物种易出现交叉反应。蛋白质三级结构在食物加工过程中可能受到破坏而影响抗体识别也是该方法的重要不足之处。(2)基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时荧光PCR和分子指纹技术等；基于DNA序列特异性的分子生物学技术以动物种属间遗传信息的差异作为肉种鉴别的检测靶点而被广泛使用。相比于蛋白质，DNA由于热稳定性高，在加工过程中虽然存在一定程度的降解，但仍能提取出小片段DNA用于PCR等分析。同时DNA具有特异性高、灵敏度高、不受组织类别限制等诸多优势，对于亲缘关系较近的物种具有较高的分辨能力。近年来，基于DNA检测技术的肉及肉制品真实性鉴别方法的研究越来越多。目前主要集中于以PCR为基础的各类分析方法，其中包括DNA测序、多重PCR、实时荧光定量PCR等。特别是实时荧光定量PCR技术在动物源性成分的检测领域，日渐成为主流检测技术。

PCR技术通过一段特异的寡核苷酸与目标DNA序列结合而在体外合成数以百万计的DNA拷贝。通过物种特异性引物对DNA片段进行扩增，通过琼脂糖电泳分离并观察特异性条带是PCR技术鉴别物种成分的最基本方法。线粒体DNA在细胞中拷贝数量大、灵敏度高、进化速度快，具有较高的种间多样性和较低的种内变异，已被广泛应用于引物设计和靶序列的扩增。如常用的线粒体基因有细胞色素b基因、12S和16S核糖体RNA亚基、D-loop区。但是，由于线粒体DNA序列的拷贝数高且不恒定，只能应用于动物源性成分的定性检测，很难应用于定量检测。“Species identification and quantification in meat and meatproducts using droplet digital PCR(ddPCR)Analytical Methods”,C.Floren,I.Wiedemann,B.Brenig,E.Schütz,J.Beck,Food Chemistry 173(2015)1054–1058，该文章的结论明确了在定量的时候使用线粒体源的引物和探针会引起结果偏差。