[发明专利]一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法。

背景技术

糖基化磷脂酰乙醇胺(Amadori phosphatidylethanolamine，Amadori-PE)是食品或生物体中的磷脂酰乙醇胺和还原糖等化合物的醛酮基发生羰胺反应而产生的一类潜在化学危害物。目前已见报道的研究表明，糖基化磷脂酰乙醇胺与糖尿病及其并发症、衰老性功能障碍以及癌症等疾病的发生存在相关性。糖基化磷脂酰乙醇胺的前体物质——磷脂广泛存在于日常膳食中。磷脂类食品在加工、储藏过程中都可能引发糖基化磷脂酰乙醇胺的安全性问题。

制备获得高纯度的糖基化磷脂酰乙醇胺标准样品是检测糖基化脂类的关键技术前提。糖基化磷脂酰乙醇胺的制备主要是将糖基化磷脂酰乙醇胺和非糖基化磷脂酰乙醇胺进行分离，目前已见报道的关于糖基化磷脂酰乙醇胺的分离方法主要有液相色谱分离法和薄层色谱分离法。Jeong-Ho Oak等人(Jeong-Ho Oak K N T M.Synthetically prepared Amadori-glycated phosphatidylethanolamine can trigger lipid peroxidation via free radical reactions[J].FEBS J.2000,481:26-30.)将含有糖基化磷脂酰乙醇胺的样品通过Bond Elut苯硼酸(PBA)筒固相萃取柱，所得脂质提取物再溶解于1mL甲醇-30％氢氧化铵(95:5，v:v)中，然后装载在相同溶剂的PBA平衡柱上。用另外3mL甲醇-30％氢氧化铵(95:5，v:v)进行洗脱，弃去洗脱液。再用5mL甲醇洗脱回收糖基化磷脂酰乙醇胺，并在相同条件下通过高效液相色谱柱进行纯化。目前，该方法在糖基化磷脂酰乙醇胺的相关研究中被大量引用。但该方法前处理操作麻烦，且并未公开用高效液相色谱法检测糖基化磷脂酰乙醇胺的检测条件。Utzmann等人(Utzmann C M,Lederer M O.Identification and Quantification of Aminophospholipid-Linked Maillard Compounds in Model Systems and Egg Yolk Products[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry.2000,48(4):1000-1008.)通过三氟甲磺酸酯、磷脂酰乙醇胺和1,8-二氮杂双环制备异亚丙基-糖基化磷脂酰乙醇胺，再加入三氟酸-水转化成糖基化磷脂酰乙醇胺产物。在高真空中除去溶剂，将残余物溶于氯仿中，通过柱色谱用氯仿-甲醇-水(体积比95:35:5)进行洗脱纯化，洗脱液通过薄层色谱柱进行检测，0.1％(w/v)的2,7-二氯荧光素甲醇溶液作为喷雾试剂。再将试剂蒸发，残余物溶解于甲醇中，通过膜过滤器，汽提出甲醇，高真空干燥得到糖基化磷脂酰乙醇胺。Sookwong等人(Sookwong P,Nakagawa K,Fujita I,et al.Amadori-Glycated Phosphatidylethanolamine,a Potential Marker for Hyperglycemia,in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats[J].Lipids.2011,46(10):943-952.)通过Folch法分离提取糖基化反应液中的脂溶性产物，再将萃取液蒸发至干，将残余物溶解于10mL氯仿-甲醇(2:1，v:v)中，然后通过制备型反相柱用甲醇-5mM乙酸铵水溶液(99:1，v:v)进行分离洗脱，制得糖基化磷脂酰乙醇胺。

由于糖基化磷脂酰乙醇胺几乎没有紫外吸收特征，只利用液相色谱法很难检测到糖基化磷脂酰乙醇胺的信号，分离提纯效率低。使用薄层色谱法则需要加入荧光性衍生试剂进行表征，然后再除去荧光性试剂，操作麻烦，且可能造成糖基化磷脂酰乙醇胺的损失。本发明方法通过固相萃取提取样品中的脂溶性产物，再通过液相色谱串联质谱检测仪获得糖基化磷脂酰乙醇胺的检测信号，确定柱保留时间。通过收集固定柱保留时间通过的分离液，氮气吹干后得到高纯度的糖基化磷脂酰乙醇胺样品。该方法操作快速，准确度高，制得糖基化磷脂酰乙醇胺的纯度高于95％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，本发明还提供了采用该方法分离提纯后得到的糖基化磷脂酰乙醇胺。该方法操作快速，准确度高，得率高，样品纯度高。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，所述方法包括：