[发明专利]尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用。本发明公开的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母的制备方法，包括：敲除多形汉逊酵母出发菌株中乳清苷‑5′‑磷酸脱羧酶基因或该基因编码蛋白质的含量或使该基因编码蛋白质失活，得到尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母；敲除乳清苷‑5′‑磷酸脱羧酶基因为下述M1)和M2)：M1)使乳清苷‑5′‑磷酸脱羧酶基因的编码提前终止；M2)在乳清苷‑5′‑磷酸脱羧酶基因中插入外源DNA片段。本发明构建的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母遗传稳定，且其他生长特性与野生型菌株没有明显差异，可用作代谢工程或合成生物学改造的底盘细胞，以及高效表达重组蛋白的细胞工厂。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用。

背景技术

酵母菌作为单细胞真核生物，是生物技术领域应用非常广泛的微生物，在大宗发酵产品、精细医药化学品和蛋白质药物的生产中发挥着非常重要的作用。多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是一种甲醇营养型酵母，能以甲醇为唯一碳源生长和诱导蛋白的高效表达；最适生长温度为37℃，对热胁迫、金属胁迫和氧胁迫等多种环境胁迫具有很好的耐受性，因此对工业环境具有广泛的适应性；外源DNA在染色体上的稳定、高拷贝整合保证了蛋白质表达的高效性、稳定性和均一性；蛋白质分泌途径和翻译后修饰机制更接近于高等真核生物，降低了重组蛋白的免疫原性风险；是公认的安全微生物(Generallyrecognized as safe,GRAS)，获得国家食品药品监督管理局(CFDA)批准认可；一些在其他表达系统不能实现功能表达的大分子蛋白、膜蛋白及结构复杂蛋白在多形汉逊酵母中得到功能性的有效表达。因此多形汉逊酵母成为高效合成重组蛋白药物及其他高值化蛋白最为理想的微生物细胞工厂。

筛选标记是对微生物菌株进行遗传改造所必需的重要工具。多形汉逊酵母遗传改造中常用的筛选标记包括抗生素抗性筛选和营养缺陷互补筛选。与抗生素抗性筛选相比，通过功能互补的营养缺陷筛选标记具有生物安全性高、假阳性率低的特点，在食品用及药用重组蛋白的高效表达中具有更广泛的应用。但目前使用的多形汉逊酵母营养缺陷型菌株多数来源于传统的物理或化学诱变，遗传稳定方面的缺陷影响筛选效率；而且原始菌株基本为美国模式菌种收集中心(American type culture collection,ATCC)的模式菌株，在产业化应用中受到限制。从源头开发具有营养缺陷筛选标记的、遗传稳定的多形汉逊酵母菌株，是充分发挥多形汉逊酵母在重组蛋白表达中的优势，实现产业化应用亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及如何在尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母中表达蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的制备方法。

本发明所提供的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的制备方法，包括：敲除多形汉逊酵母出发菌株中尿嘧啶合成途径中基因或降低所述多形汉逊酵母出发菌株中所述尿嘧啶合成途径中基因编码蛋白质的含量或使所述多形汉逊酵母出发菌株中所述尿嘧啶合成途径中基因编码蛋白质失活，得到尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母；所述多形汉逊酵母出发菌株含有所述尿嘧啶合成途径中基因。

所述多形汉逊酵母出发菌株可为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP20110424，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.7.89。

上述方法中，所述尿嘧啶合成途径中基因可为乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因。

上述方法中，所述乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因可为如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)编码序列是序列表中序列1的DNA分子；

A2)编码序列是序列表中序列1的第634-1425位的DNA分子；