[发明专利]一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法

说明书

本发明公开了一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。属于医药检测技术领域，本发明方法主要包括以下步骤：芍药苷肝微粒体的转化；样品前处理；液质联用方法进行肝微粒体中芍药苷代谢物的测定。本发明的优点在于：操作简便，样品处理简单、分析速度快、特异性强、灵敏度高。该方法可以同时检测芍药苷在肝微粒体中更多的代谢产物，且用该分析方法能更多、更准确推测出代谢产物的结构，为研究芍药苷在肝微粒体中的体外代谢产物提供技术支持，对深入研究活性产物及其作用机制具有重要意义。

技术领域

本发明属于医药检测技术-生物化学分析领域，具体涉及一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。

背景技术

赤芍为我国的传统中药材，始记载于《本经》，具有清热凉血，散瘀止痛的功效，可用于温毒发斑，跌扑损伤，肝郁肋痛，经闭痛经和臃肿疮疡等症。赤芍中的化学成分较复杂，但赤芍中的单萜苷类成分被认为是赤芍的主要活性成分，主要有芍药苷等。现代药理学表明，芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿等多种作用。

从当前国内的研究内容看，主要是对赤芍的化学成分、质量控制及药理作用机制研究为主，涉及赤芍中活性部位芍药苷的体外代谢结构鉴定研究相对较少。现代药理学表明，芍药苷具有很多药用功效，但口服用药时，生物利用度很低，有学者推测可能是在体内发生了代谢，代谢产物为发挥药效部分，因此研究药物的代谢产物对于深入研究药物活性产物及其作用机制具有重要意义，对于科学用药具有指导作用，同时对促进赤芍新药开发和剂型改进均具有重要意义。肝脏是药物体内代谢的主要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢庞大的细胞色素P450酶系，是药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢的主要场所。由于药物体内代谢过程中，原型药物及其代谢产物的浓度低，体内干扰因素多，而体外代谢研究方法简单，易控制，能排除内源性物质的干扰、准确找到代谢产物。因此，肝微粒体体外实验作为体外代谢物研究越来越重要。

常用检测技术过程时间长，实验误差较大，无法做到高通量同时检测大量的代谢产物，芍药苷代谢产物结构非常类似，无法用常规检测方法检测区分，特异性差。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空缺，提供了一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。本发明的方法具有操作简便、样品处理简单、分析速度快、特异性强、灵敏度高。揭示了中药赤芍中芍药苷的体外代谢特征，对了解药物在体内产生作用的分子形式，了解药物的代谢机制，推测其作用靶点，进而对赤芍新药开发和剂型改进具有重要意义。

本发明采用的技术方案为：一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，包括以下步骤：

1)肝微粒体中芍药苷代谢产物的获得：在培养瓶中，于Tris-HCl缓冲溶液中，加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl₂，混合均匀，在37℃全温振荡器中温孵5min后，加入芍药苷的Tris-HCl缓冲溶液，得温孵体系；温孵1-3h，温孵过程中，每20min在液面上通O₂半分钟，反应后，将培养瓶从振荡器中取出，迅速加入甲醇终止代谢反应，得芍药苷代谢产物。

2)样品处理：将芍药苷代谢产物涡旋振荡30s，转速5000r/min下离心10min，吸取上清液，旋转蒸干，加入甲醇振荡复溶，再次离心，吸取上清液，在氮气下吹干后，残留物用甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱检测。

3)样品测定：芍药苷代谢产物的检测，具体条件如下：

色谱条件：色谱柱：Diamonsil^TMODS C₁₈；

流速：0.2mL/min；

柱温：30℃；

进样量：1μL；

检测波长：230nm；