[发明专利]一种肿瘤细胞检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞检测技术领域，特别是涉及一种肿瘤细胞检测方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指原发的实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞；播散肿瘤细胞(disseminated tumor cells,DTCs)是指播散到体液如骨髓、腹水、胸腔积液、尿液等中的肿瘤细胞。CTCs/DTCs检测作为一种新型无创的非侵入性检测方式越来越得到重视。其在肿瘤复发与转移、临床评估、个体化治疗及预后观察等方面的应用价值已逐渐体现出来。2007年美国临床肿瘤学会还将CTCs和DTCs作为乳腺癌的新型肿瘤标志物，并引入到国际肿瘤分期系统。对于一些难以获得组织标本的恶性肿瘤类型，如肺癌、乳腺癌、结肠癌等，CTCs/DTCs检测是唯一可获得的肿瘤细胞的方式。因此，CTCs/DTCs的检测可作为肿瘤的早期诊断、预后评估及个体化治疗的重要疾病标志物。但是，CTCs和DTCs的共同特点是往往在外周血和体液中含量非常低。

目前，临床检测DTCs方法主要是化学染色、免疫组化及流式细胞技术。化学染色灵敏度低，无法满足临床对CTCs及稀有DTCs检测的敏感性和特异性的要求。免疫组化及流式细胞技术均需依赖抗体的特异性。免疫组化法的结果又会受到多种因素的影响，如组织的固定方式、抗原修复的方式等。现阶段免疫组化通常是人工完成，结果的判断主要依靠操作者的经验，缺少标准的评估方案。流式细胞技术的发展虽然克服了以上问题，可客观分析细胞表面及细胞核内的多种蛋白，但其临床应用仍然受到所用荧光标记抗体昂贵、易失活猝灭，检测仪器昂贵等的限制。

因此，发展简单、快速、超灵敏的CTCs/DTCs检测技术对肿瘤的早期诊断和精准治疗具有重要的临床意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞检测方法，用于解决现有技术中细胞检测的成本较高、灵敏度低、特异性差等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：

1)制备环状模板；

2)向肿瘤细胞悬液中加入适体-引物复合探针，反应得到结合有适体-引物复合探针的细胞团，配制含有步骤1)所得环状模板的滚环扩增体系，将所述细胞团与滚环扩增体系混合， 使得适体-引物复合探针识别并触发靶细胞表面滚环扩增，得反应液；

3)测定步骤2)所得反应液的比色信号。

进一步地，步骤1)中，环状模板序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，步骤1)中，包括环状模板的连接反应和剪切纯化。

进一步地，步骤1)中，环状模板的连接反应包括：将引物链与锁式探针结合，得到环状模板，所述锁式探针为5’磷酸化的锁式探针，其序列如SEQ ID NO.1所示。根据检测方法的需要，可以设计不同的引物链和锁式探针，进而得到不同的环状模板。

进一步地，步骤1)中，引物链序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，步骤1)中，将引物链和锁式探针加入到T4DNA连接酶缓冲液中，95℃下变性5分钟，再自然冷却至室温(25℃)。

进一步地，步骤1)中，加入T4DNA连接酶后，在16℃下反应得到环状模板。

进一步地，步骤1)中，对环状模板进行剪切纯化时，在连接好的环状模板体系中加入Exo I和Exo III，消化水解连接体系中多余的未连接的DNA单链和副产物双链，反应结束后，灭活酶活性，采用试剂盒提纯过滤，得到纯化的环状模板。

进一步地，步骤1)中，加入Exo I和Exo III后，37℃反应4小时。

进一步地，步骤1)中，反应结束后，水浴加热至90℃灭活10分钟。

进一步地，步骤2)中，适体-引物复合探针序列如SEQ ID NO.3所示。当然，可以根据需要设计不同的适体-引物复合探针。

进一步地，步骤2)中，适体-引物复合探针识别结合靶细胞时，将肿瘤细胞悬液与适体-引物复合探针混合后，反应时间为10-50min。

进一步地，步骤2)中，将所述细胞团与滚环扩增体系混合后，反应时间为10-50min

进一步地，步骤2)中，适体-引物复合探针识别结合靶细胞时，将肿瘤细胞悬液与适体-引物复合探针混合后，在25℃下反应。

进一步地，步骤2)中，将所述细胞团与滚环扩增体系混合后，在37℃下反应。