[发明专利]基于长片段DNA环化和三代测序的无创产前单体型构建方法

说明书

一种基于长片段DNA环化和三代测序的无创产前单体型构建方法，包括：用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建长片段环化DNA分子文库；将环化DNA分子文库打断成片段；构建三代上机测序文库并进行三代测序；从测序读长上目标基因的突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点；不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合。本发明的方法实现了父母个体单体型构建，解决了目前常用依赖父母子家系单体型分析无创产前检测不适用于无法获得先证者样本家系检测的弊端。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种基于长片段DNA环化和三代测序的无创产前单体型构建方法。

背景技术

世界卫生组织2015年出生缺陷报告显示，全球每100个新生儿就有约3个携带出生缺陷相关的基因，每年有320万出生缺陷新生儿诞生，其中27万新生儿死于出生缺陷。研究表明，绝大部分出生缺陷与遗传因素有关，单基因缺陷是重要因素之一，目前对于绝大多数单基因缺陷都没有可根治的措施，只能终生替代治疗，且存活下来的出生缺陷儿多为终生残疾或智力障碍，无法治愈，由此给社会和家庭造成了沉重的经济和心理负担。对高风险孕妇进行产前检测是一种防止出生缺陷发生的有效手段。

随着孕妇外周血浆中胎儿游离DNA存在的发现，为无创产前检测胎儿基因型提供了可能。避免了由于羊水穿刺、绒毛膜取样和脐带血穿刺等有创取样方式造成流产风险及缩小需进行羊水穿刺的高危妊娠人群。传统单基因缺陷无创产前检测技术并未获得广泛应用，其原因主要是母体血浆母源基因组背景的影响，直接对单点分析所获得的胎儿母源位点遗传信息存在错误可能；血浆胎儿含量定量不准确造成假阴性；对存在假基因无法使用。家系连锁单体型信息分析是目前无创单基因缺陷检测构建父母单体型的主要技术方法。

目前构建单体型的方法，多采用检测突变位点和多个与其连锁的短串联重复序列(STR)或单核苷酸多态性(SNP)来确定突变连锁单体型。STR连锁分析存在STR连锁标记位点较少的问题，具体案例中可能没有可用STR位点，需要大量预实验，且STR大多距离缺陷位点较远，无法排除重组带来错诊的可能性。基于单体型分析多采用父母先证者家系基因组捕获测序或SNP分型的方法首先获得与缺陷位点关联的单体型，多重PCR操作复杂，家系捕获测序成本较高，推广较难，且需要父母子家系样本同时获得，但是在实际应用中通常会碰上待测夫妇双方子代样本不可获得的情况，比如陆思嘉公开了“一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法”(公开号：CN105385755A)。

因此，建立一种不依赖于父母子数据的单体型构建实验方法，对于进一步推广无创单基因缺陷检测技术有很重大的意义。

发明内容

本发明提供一种基于长片段DNA环化和三代测序的无创产前单体型构建方法，实现父母个体单体型构建。

本发明通过如下技术方案实现：

一种基于长片段DNA环化和三代测序的无创产前单体型构建方法，包括：

(1)用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建环化DNA分子文库；

(2)将上述环化DNA分子文库打断成片段；

(3)用上述片段构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；

(4)在上述测序读长上，从目标基因的突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点，其中一条测序读长含有多个SNP位点时，该测序读长长度即是一条单体型的长度；

(5)不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合，最终得到与上述突变点连锁的单体型。

进一步地，用于构建上述环化DNA分子文库的上述基因组DNA的量是10μg以上。