[发明专利]一种高密度、高稳定性的核酸芯片及其制备方法

说明书

本发明涉及基因芯片技术领域，公开了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，包括(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在65℃左右进行反应获得核酸芯片。本发明还提供了本发明的方法制备的用于核酸芯片的片基和核酸芯片。

技术领域

本发明涉及基因芯片技术领域，特别涉及一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法。

背景技术

基因芯片又称DNA芯片，广泛应用于DNA测序，基因表达和表达差异，基因突变和基因组多态性检测，病原分析，基因诊断和疾病预后分析，病理学、毒理学、药理学、疫苗研究和肿瘤研究等多个方面。

基因芯片的制备方法主要有物理吸附、共价键连接、链亲和霉素-生物素三种方法。第一，物理吸附主要是利用DNA探针带负电荷与固相支持表面的正电荷之间的吸引力的作用。物理吸附的优点是不需要对核酸进行修饰，简单、直接、快速等；缺点是连接DNA探针杂乱无章拥挤没有方向性，比较容易解析，不能够重复利用等。第二，共价键连接是利用固相支持物表面进行化学修饰活化，对核酸末端进行化学官能团修饰，通过化学共价键将DNA探针连接到固相基底。共价键连接的优点是连接稳定好，键合力强，可以重复利用等；缺点是需要利用各种化学分子进行键合作用，键合时间长，不可逆转性，局部拥挤效应等。第三，链亲和霉素-生物素是利用链亲和霉素修饰在固相支持物上，将生物素修饰在DNA末端，通过利用链亲和霉素与生物素之间的相互作用使得DNA固定化。链亲和霉素-生物素的优点是有比较好的方向性、特异性和功能性，比较容易控制，可逆转性等；缺点是价格昂贵，芯片生产缓慢，拥挤效应，特定的生物适合的条件要求，不能重复利用等。图1是DNA芯片的制备方法的示意图。

目前，商业化基因芯片主要为氨基芯片和醛基芯片，二者都属于共价键连接的芯片。其中醛基芯片适用于DNA富集，但醛基芯片上的化学官能团修饰为可逆反应，DNA探针容易脱落，连接不稳定。图2是商业化DNA芯片醛基芯片的制备示意图。

因此，本领域需要改进核酸与固相支持表面的连接。

发明内容

本发明的目的在于克服目前现有技术的不足，提供了一种新型的、简单的化学修饰方法，高密度、高稳定地连接目标核酸探针。本发明通过对固相基底材料表面进行氨基衍生、活性基团氯修饰，进而连接氨基核酸探针,制备出高密度，高稳定性的核酸芯片。

因此，本发明提供了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；

(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；

(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；

(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；

(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应；

(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；

(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在60℃至70℃，优选65℃下进行反应获得基因芯片。