[发明专利]一种检测多种虫媒病毒和无脊椎动物感染病毒的试剂盒

说明书

本发明提供一种检测多种虫媒病毒和无脊椎动物感染病毒的试剂盒，属于荧光PCR检测技术领域。本发明试剂盒含有针对11个无脊椎动物病毒科和5个虫媒病毒科共158种病毒的35对特异性引物、35个阳性质粒标准品、荧光PCR反应液和无菌H₂O，所述35对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑70所示；阳性质粒标准品的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.71‑105所示。本发明试剂盒能快速检测上述各类虫媒病毒和无脊椎动物感染病毒，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、检测结果可靠稳定等优点，可用于昆虫细胞生产系统的昆虫病毒安全性检测，提高药品安全性，在生物制品生产领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种利用荧光-PCR反应技术检测昆虫细胞多种无脊椎动物感染病毒和虫媒病毒的试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

虫媒病是指以吸血的节肢动物作为媒介通过叮咬感染造成人和人、人和动物间传播的一种疾病。动物临床表现为突然发热、感觉酸疼无力、大面积皮疹、继发性感染造成死亡等。该病过去曾使成千上万的人畜感染甚至死亡，给经济和人类社会发展带来了一定的负面影响。20世纪中叶后，随着全球往来加强，也促进了国际动物贸易不断发展，特别是现代化交通工具的使用缩短了世界各地的距离，这些因素为虫媒病的远距离传播和在全球范围内扩大流行的趋势提供了更广泛的可能性。目前，随着国际交往的日益频繁，蚊、蜱、蠓等媒介传入我国边境口岸的风险非常大，虫媒性动物疫病的爆发也有可能随生物虫媒传入我国。

采用昆虫细胞生产系统作为蛋白生产平台已有多个产品尝试，其中GSK公司的CervarixHPV(人乳头瘤病毒)疫苗和Protein Science公司的FluBlok流感疫苗已在国外上市。监控昆虫细胞生产系统的安全性，建立昆虫细胞外源病毒质控体系，是控制药物安全性的重要方法之一。

与哺乳动物细胞的病毒风险谱考虑不同，昆虫细胞的病毒安全性评价除考虑常规的病毒风险外，必须同时考虑昆虫的特定病毒风险，包括无脊椎动物病毒和虫媒病毒，如目前有文献报道HighFive细胞中存在野田村病毒(nodaviruses)的感染、Sf9细胞中有弹状病毒(rhabdoviruses)的感染，因此建立建立无脊椎动物病毒和虫媒病毒的检测方法对于控制药物生产的安全性至关重要。

无脊椎动物感染病毒包括：(1)Ascoviridae囊泡病毒科，(2)Iridoviridae虹彩病毒科，(3)Poxviridae痘病毒科，(4)Polydnaviridae多分DNA病毒科，(5)Baculoviridae杆状病毒科，(6)Parvoviridae细小病毒科，(7)Birnaviridae双核糖核酸病毒科，(8)Reoviridae呼肠孤病毒科，(9)Nodaviridae罗达病毒科，(10)Picornaviralses微核糖核酸病毒科(Dicistroviridae二顺反子病毒科)，(11)Tetraviridae四病毒科。虫媒病毒包括：(1)Reoviridae(orbiviruses)呼肠孤病毒科(环状病毒科)，(2)togaviruses披膜病毒科，(3)flaviviruses黄病毒科，(4)Bunyaviruse布尼亚病毒科，(5)asfarviruses猪瘟病毒。

荧光PCR是一种直接检测核酸并可进行定量的分子生物学技术。具有特异性好、灵敏度高、精确性好、操作简单和防污染等优点。它是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。本发明采用不同种荧光PCR的方法对样本核酸进行扩增检测，以鉴定样品中是否有虫媒病毒和无脊椎动物病毒的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用荧光PCR对昆虫细胞及由其制备的样本中虫媒病毒和无脊椎动物病毒污染检测的试剂盒，利用本试剂盒可以快速、准确的检测样品是否有虫媒病毒和无脊椎动物病毒感染。

本发明首先提供了检测虫媒病毒和无脊椎动物感染病毒的特异性引物对组合，包括如下：