[发明专利]一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用

说明书

本发明公开一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用，该方法包括如下步骤：通过液质联用建立待筛选中药苦参提取液指纹图谱；分离与培养背根神经节细胞；利用背根神经节细胞膜固相化结合筛选苦参提取液中的效应成分；洗脱未结合成分；解离并通过液质联用检测活性成分解离液成分。本发明用小鼠DRG细胞固相色谱技术作为抗瘙痒药物初筛的细胞模型，为筛选具有“止痒”作用的中药活性成分提供了新方法，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于中药活性成分筛选及作用机制研究领域，特别涉及一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法及其应用。

背景技术

传统细胞膜色谱(Cell Membrane Chromatography，CMC)首先需要制备细胞膜，再采用硅胶吸附的方法制备固定相，通常将固定相湿法装柱后以磷酸缓冲液为流动相，分析比较中药成分在色谱柱上的保留特性。细胞膜色谱力求尽量保持受体的“原位”性，模拟受体生存环境，使得药物分子与受体的相互作用更接近真实状态，研究细胞膜上的受体与配体的结合特性。细胞膜色谱同时也存在明显的不足，例如细胞受体的结合位点在细胞膜内外都存在，有分类方法将受体种类分为离子通道型、G-蛋白偶联型、酪氨酸激酶型以及细胞核内受体等，实际上还有细胞浆、细胞器内的各种酶等。细胞膜色谱研究中由于活细胞的破坏使得细胞内受体不复存在，因而失去了验证作用于这部分靶点的效应成分的机会。还有部分受体是由于另一些受体被激活后，通过活细胞的各种信号传导通路而被激活，这部分受体由于偶联作用需要活细胞的功能，其配体也不容易为细胞膜色谱所发现。此外该方法对流动相缓冲溶液的组成、pH值、柱温、柱压、流速等要求苛刻，难以最大限度保持细胞受体活性。通过细胞膜固相色谱(Cell Membrane Immobilized Chromatography，CMIC)技术，将细胞与药液孵育使药液中活性成分与细胞膜表面受体结合，冲洗未吸附成分，再解离并检测吸附成分。省去了将细胞固定在硅胶这一步，既节约经费和时间，又有利于保持生物靶点的活性，是对CMC技术的一大创新和改进。目前已有研究人员利用多种生物材料如原代巨噬细胞，脾细胞，肺组织细胞成功用于三七、脉络宁等中药活性成分的辨识，显示出良好的应用前景。

痒觉，尤其是慢性瘙痒的具体传导分子机制目前还不完全明确，且经常在多种疾病中作为并发症出现，据统计，美国特应性皮炎患者每年的医疗花费也已超过3亿美元。但目前慢性瘙痒的治疗不容乐观，由于各种慢性瘙痒的病理机制不同，现在市场上并没有可以有效治疗各种慢性瘙痒疾病的特效药或医疗措施。对于占比超过80％的慢性顽固性瘙痒，目前常见的止痒药往往疗效欠佳或有较严重副作用，例如临床上治疗瘙痒常用的抗过敏药、抗组胺药、糖皮质激素可能导致的精神萎靡、免疫紊乱等症状。因此阐明痒觉的产生与传导机制、筛选有抗瘙痒活性的物质对瘙痒的防治、抗瘙痒药物的开发极其重要。

实验研究中可将痒觉分为组胺依赖型瘙痒(由致痒剂直接或者间接引起组胺释放而引起的瘙痒)与组胺非依赖型瘙痒(由不会引起组胺释放的致痒剂引起的瘙痒)，组胺依赖型瘙痒多为急性瘙痒例如荨麻疹、过敏引起的风团湿疹等可以通过服用组胺拮抗剂治疗；而组胺非依赖型瘙痒则多数为慢性顽固性的瘙痒，组胺拮抗剂通常疗效欠佳，例如特应性皮炎、接触性皮炎、银屑病等瘙痒。由于目前对组胺非依赖型瘙痒并无有效的疗法或药物，因此对组胺非依赖型瘙痒的机制研究是神经生物学领域一个极具挑战性的研究课题，而对其药物的开发也是目前皮肤病药物研究的一大热点。

由于瘙痒是一种复杂的神经生理行为，因此抗瘙痒药物多数都是直接运用动物行为学来筛选，耗费大量时间与金钱，如何更为高效筛选抗瘙痒药物成为目前亟待解决的问题。随着神经科学的发展，对痒觉的研究逐渐深入，并发现了初级传入神经元上大量痒觉相关受体和免疫与痒觉的联系。本发明以此为基础用细胞筛选传统抗瘙痒中药苦参中的活性成分，并验证其活性成分的抗瘙痒效果。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种筛选中药神经活性成分的细胞膜固相色谱法。

本发明的又一目的在于提供的所述细胞膜固相色谱法在中药神经活性成分筛选中的应用。