[发明专利]一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法

说明书

本发明涉及一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，包括：将蛹虫草自身的CmSnf1基因构建同源重组载体及回补过表达载体，经过农杆菌介导的转化，转入到蛹虫草菌株中，通过抗性筛选获得转基因菌株。本发明通过转基因技术获得了蛹虫草的CmSnf1基因敲除突变菌株，该突变菌株和野生型菌株及回补菌株相比，其发酵液中虫草素的产量提高7倍以上，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

技术领域

本发明属于蛹虫草栽培领域，特别涉及一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法。

背景技术

作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)(Sungetal.,2007)。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎症、杀虫、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神经保护、肾保护等功能，在肿瘤治疗、器官移植、肝肾移植和心脏保护等方面具有重要作用。其主要成分包括四类：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素有抗病毒、抗肿瘤作用。，以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技发达国家的高度重视。它能抑制病毒的RNA合成；对枯草杆菌和鸟结核杆菌均有抑制作用；对HIV-I型病毒也有杀伤作用；尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用。因此，将其作为一种用途广泛的新药来开发是必然的趋势。

Snf1基因是Snf1蛋白激酶复合体的一个组分，是哺乳动物、植物、真菌等维持体内能源代谢所必需的(Hardieetal.,1998,Annualreviewofbiochemistry67:821-855)，其在真核生物中高度保守。在酵母(Saccharomycescerevisiae)中，Snf1是酵母为适应葡萄糖有限的环境下利用其他碳源，如蔗糖、乙醇、乳糖等多必需的；在赤酶菌(Gibberellasaubinetii)中，GzSnf1基因的敲除影响了该菌的有性、无性生殖，改变了赤酶对碳源的应用(Leeetal.,2009,EukaryotCell8(1):116-127)；在青霉(Penicilliumdigitatum)中，PdSnf1基因在正常条件下并不参与CWDE基因的表达调控，然而在以果胶为碳源的生长条件下，PdSnf1基因参与CWDE基因的表达调控；PdSnf1基因缺失突变菌株在以不同碳源的条件下(如葡萄糖、蔗糖、果胶、果糖、甘油等)，突变体的生长速度变慢，菌丝生长受到不同程度的抑制(Zhang，etal.,2013,ApplMicrobiolBiotechnol.DOI10.1007/s00253-012-4593-z)。通过酵母Snf1的氨基酸同源性的比对，在已测序的蛹虫草CM01中找到其同源基因CCM_05552，该基因与酵母的蛋白序列相似性为60％，与食用真菌草菇的蛋白序列相似性为51％，香菇的蛋白序列相似性为38％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，该方法通过转基因技术获得了蛹虫草的CmSnf1基因敲除突变菌株，该突变菌株和野生型菌株及回补菌株相比，其发酵液中虫草素的产量提高7倍以上，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

本发明的一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，包括：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；将目的基因CmSnf1的上下游片段利用引物进行PCR扩增，将扩增片段构建到PDHt-bar上，得到PDHt-bar-CmSnf1载体；

(2)将上述PDHt-bar-CmSnf1载体转化根癌农杆菌，通过平板培养选出含有目的载体的菌株；(3)将蛹虫草孢子和步骤(2)得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株。