[发明专利]一种用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)是目前生产药物蛋白最常用的宿主细胞，被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产。抗体药物是当前最主要的生物技术类药物，如何进一步提高CHO细胞抗体药物的效能和产量，是目前研究的热点。

α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6fucosyltrasnferase,FUT8)是岩藻糖基转移酶基因超家族的一员，FUT8催化的核心岩藻糖基化是糖蛋白重要的翻译后修饰和功能调控方式。利用宿主细胞表达抗体药物时，抗体的糖基化修饰影响其在体内的功能和稳定性。研究表明，与岩藻糖基化的抗体相比，去除或降低岩藻糖基化的抗体会表现出更强的ADCC效应(抗体依赖性细胞毒性)，抗体性能佳。因此，敲除工程细胞株的FUT8，使表达的抗体无岩藻糖基化修饰，是提高抗体性能的有效手段。

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一种催化5，6-二氢叶酸还原为5，6，7，8-四氢叶酸的蛋白酶，参与细胞内的嘌呤代谢过程。当细胞株缺失了DHFR基因，将携带DHFR基因的表达载体转染细胞，阳性细胞也就获得了DHFR基因，此时在培养基中加入甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)，会导致DHFR基因扩增，连带其两侧片段也得到相应扩增，可使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍，从而达到目的基因的高效表达。因此，急需要敲除CHO细胞株的DHFR基因，以提高外源基因蛋白表达量。

Crispr/Cas9系统，是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的免疫入侵系统，在现代基因工程应用领域与TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技术并列成为三大基因组编辑工具。CRISPR-Cas9技术具有特异性DNA识别能力，Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guide RNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。相比较于TALEN及ZFN技术，其sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，易于操作，而且效率更高、更容易得到纯合子突变体。

目前研究中，未见通过CRISPR-Cas9系统，敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的的试剂盒及其用途。

FUT8基因：为α-(1,6)-岩藻糖基转移酶基因；

DHFR基因：为二氢叶酸还原酶基因。

本发明提供了一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所述的sgRNA序列，以及SEQ ID NO：23所述的sgRNA序列。

本发明还提供了一种用于敲除CHO细胞中FUT8基因和DHFR基因的试剂盒，它包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：31所述的sgRNA序列

本发明还提供了上述试剂盒在用于敲除CHO细胞中FUT8和DHFR两种基因的用途。

本发明还提供了上述试剂盒在制备FUT8和DHFR基因同时缺失的细胞株中的用途。

本发明还提供了一种同时敲除CHO细胞中FUT8和DHFR基因的方法，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对两种基因进行改造，步骤如下：

a、合成SEQ ID NO：1和/或3所述的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

b、将步骤a的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；

c、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认FUT8基因被敲除，并获得FUT8基因缺失的细胞株FUT8-/-，备用；

d、合成SEQ ID NO：23所述的序列及其互补链，变性、退火，形成双链，插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

e、取步骤c的FUT8-/-细胞株，用步骤d的重组表达载体转染，挑取单个细胞，接种培养；