[发明专利]一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法。

背景技术

军团菌属细菌（Legionella sp.）是一类革兰氏阴性菌，广泛存在于天然淡水或人工水体中。该菌的许多种类一旦以气溶胶的方式被易感人群吸入肺中，即有可能在肺泡中繁殖，并导致军团病（Legionellosis或Legionnaires’ disease, LD）。军团病可分为庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌肺炎（Legionnaires pneumonia）。前者是一种自限性流感样疾病，后者按严重程度从轻微咳嗽到快速致命的肺炎不等。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是军团病最主要的致病原。1976年，美国费城召开的退伍军人大会上暴发了一场大规模感染，221人出现非典型肺炎症状，34人死亡；次年分离出致病菌株，即嗜肺军团菌。此后，军团菌病在世界各地时有暴发流行，我国也于1982年首次报道了军团菌病的临床病例。研究表明，军团菌肺炎暴发的首要风险来自于中央空调冷却塔和供水系统；卫生部也于2012年发布的《公共场所集中空调通风系统卫生规范》中明确指出，集中空调系统冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。随着我国城市化水平的提高，空调及供水系统普及，嗜肺军团菌的检测对预防军团菌病的爆发和流行无疑具有重要意义。

自军团菌病于1977被报道以来，环境中嗜肺军团菌的检测就获得极大的重视，各种检测方法也不断出现。传统的嗜肺军团菌检测方法有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测等。细菌培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”，但其生长所需营养丰富，耗时长，检测成本高且效率低下；血清学检测则存在滞后性，缺乏早期诊断意义；尿抗原检测对血清型1型（LP1）以外的嗜肺军团菌敏感性较低。而近年来发展起来的分子生物学技术以其快速、简便、特异、敏感等优点，已在嗜肺军团菌检测及军团病快速诊断方面占有一席之地。其中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）无疑是一种相对成熟、应用广泛的方法。但是，PCR依赖于热循环完成扩增，在实际应用中往往离不开昂贵的仪器热循环仪（即PCR仪）。

交叉引物扩增法（Cross Priming Amplification, CPA）是由杭州优思达生物技术有限公司发明的DNA恒温扩增技术（专利号200810134583.1）。CPA利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）及多条引物，在65℃恒温条件下可实现目标区域高效、快速的扩增。该方法的重点和难点在于引物组的设计，即各引物的位点选择与引物序列确定。目前，尚未有将CPA应用于嗜肺军团菌检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中嗜肺军团菌检测技术的缺陷和不足，建立了一种嗜肺军团菌的CPA检测方法，其检测靶标为嗜肺军团菌IVB型分泌系统（Type IVB secretion system, T4BSS）的结构基因dotA。所述方法简便、快速、高效，特异性强，灵敏度高，对仪器要求低，且扩增灵敏度高于普通PCR，具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组。

本发明另一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种检测嗜肺军团菌的CPA引物组，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR，其序列依次如SEQ ID NO：1～5所示。

目前的研究表明，dotA基因对嗜肺军团菌至关重要，缺失dotA的嗜肺军团菌将完全丧失毒力和感染能力。因此本发明通过比对嗜肺军团菌IVB型分泌系统（Type IVB secretion system, T4BSS），以结构基因dotA为靶标设计筛选了CPA检测引物组，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR。所述寡聚核苷酸链能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现。

同时，所述CPA引物组在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用，以及在制备嗜肺军团菌检测试剂或试剂盒中的应用。亦在本发明保护范围内。

一种快速检测嗜肺军团菌的方法，包括如下步骤：