[发明专利]一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法

权利要求书

1.一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）固体发酵产β-葡萄糖苷酶：将筛选得到的厚垣镰孢霉HML278通过生理盐水制成孢子液，并将孢子液转入以甘蔗渣和麸皮为碳源的固体培养基中固态发酵，产含β-葡萄糖苷酶的培养物；

（2）制备粗酶液：将步骤（1）制得的培养物加入200-250 mL无菌ddH₂O，30℃-50℃恒温水浴1-3h浸提，四层纱布过滤，5000-7000 r/min离心5-15 min得到粗酶液，收集上清酶液2℃-6℃保存备用；

（3）非变性凝胶电泳：在2℃-6℃条件下，用步骤（2）中收集到的上清酶液在分离胶质量分数为5%-10%、浓缩胶质量分数为2%-8%、恒定电压为30V-100V的条件下进行非变性凝胶电泳22h-25h，得到含β-葡萄糖苷酶的凝胶；

（4）β-葡萄糖苷酶活性染色：在2℃-6℃条件下，剪切步骤（3）中含β-葡萄糖苷酶的凝胶得到凝胶胶条，对该凝胶胶条活性染色，活性染色液为质量分数为0.1%的七叶苷和质量分数为0.03%的三氯化铁，在25℃-35℃下反应3 min-10 min，凝胶胶条中含有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白催化底物产生黄黑色产物，以该染色凝胶胶条为导向，可确定步骤（3）中电泳凝胶上含有β-葡萄糖苷酶的活性蛋白条带的位置；

（5）提取：在2℃-6℃条件下，以步骤（4）中染色凝胶胶条为导向，将步骤（3）中电泳凝胶上含有β-葡萄糖苷酶的活性蛋白条带剪下，放入预冷研钵中磨碎后用pH为4.0-5.5、质量浓度为10-30mmol/L的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液浸提10-15h，再用5000道尔顿超滤管以3000-5000r/min的转速离心15-30min浓缩脱盐；

（6）纯化：在2℃-6℃条件下，将步骤（5）中的酶液洗脱分离蛋白质，洗脱分离蛋白质的工艺条件是以pH为7.2-7.5的0.05-0.10mol/l的PBS缓冲液添加0.15-0.20mol/L的NaCl溶液为洗脱缓冲液、洗脱压力为73-75psi、洗脱缓冲液流速为1-3mL/min，得到精制β-葡萄糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述步骤（1）中固体发酵时间为3-5天，固体发酵温度为25℃-40℃。

3.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中上清酶液在分离胶质量分数为8%、浓缩胶质量分数为4%、恒定电压为50V的条件下进行非变性凝胶电泳23h，得到含β-葡萄糖苷酶的凝胶。

4.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述步骤（4）中凝胶胶条活性染色是在30℃下反应5min。

5.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述步骤（5）将活性蛋白条带剪下，放入预冷研钵中磨碎后用pH为4.8、质量浓度为20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液浸提12h，再用5000道尔顿超滤管以4000r/min的转速离心20min浓缩脱盐。

6.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述步骤（6）中洗脱缓冲液流速为2mL/min。

7.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶在生物乙醇、造纸方面的应用。

8.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶在将纤维二糖水解得到葡萄糖方面的应用。

9.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶利用低分子量单糖合成纤维三糖和纤维四糖方面的应用。