[发明专利]一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法。

背景技术

人类的眼睛可能会接触到化妆品、药品、农药和环境污染物等一种或多种物质，对这些外源物质的主观接触或意外暴露可能造成人群的健康风险。因此，评估可能接触物质的潜在眼刺激性对保障人群健康具有重要意义。19世纪30年代，由于允许未经检测含有对苯二胺的睫毛产品在美国市场售卖，导致消费者使用此类产品引起眼部过敏、角膜溃疡和失明等不良反应。这一公共危害事件促使美国食品药品和化妆品监督管理局(FDA)在1938年采取行动，强制要求检测眼部接触产品的安全性。

对于眼刺激性的毒理学评价，金标准采用的是1944年Draize提出的兔眼刺激体内实验。一直以来，虽然兔眼实验被认为是评估眼刺激或腐蚀性的唯一标准方法，但其科学性和合理性备受质疑。传统动物实验的缺点包括：方法的主观性、动物与人体反应的差异、周期长、通量低、使用活体动物造成动物痛苦死亡等。随着国际动物福利运动的兴起和新技术的发展，50多年前国外最先提出了以"减少(reduction)"、"替代(replacement)"和"优化(refinement)"为核心内容的“3R 原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，以体外替代技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接收和认可。如欧盟化妆品指令《2003/15/EC》和法规《1223/2009/EC》对于化妆品动物实验的禁止，欧盟新化学品法规REACH(化学品的注册、评估、许可和限制)鼓励动物试验替代方法的开发和应用。美国替代方法研究评价中心(ICCVAM) 提出的一系列非动物测试方法等。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止/部分禁止或限制动物试验的进行。尤其是在化妆品领域，2013年欧盟范围内全面禁止销售从原料到成品经过动物试验的化妆品。用非活体动物的试验系统进行眼刺激性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。

体外替代试验是根据体内眼损伤发生的机理开发的，目前开发中的眼刺激替代方法，其实验系统可分为细胞系统、器官型系统、人工角膜等，其中，器官型系统主要有鸡胚绒毛膜尿囊膜和离体角膜。离体角膜来源于废弃的动物眼球组织，不需要额外动物来源，天然角膜与人体角膜接近，离体角膜在短期内可以维持正常生理活性，可以模拟人角膜暴露。牛角膜浑浊度渗透性试验(TG 437) 经过OECD认可，作为替代传统动物试验评价急性眼刺激性的方法之一，用于分类和标示，其数据广泛被接受。然而实际中可能接触到多种外源化学物，且重复接触，例如药物、大气污染物等，国际上尚未认可多次眼刺激性体外方法。目前基于离体角膜的多参数重复暴露眼刺激性体外预测/评价方法未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提供一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，该方法具有快速、通量高、不使用活体动物等优点，可以对一种/多种物质多重/多次暴露眼刺激性进行快速评价/预测，且能广泛应用。

解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案来实现的。

一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，其特征是含以下步骤：

S1，离体动物眼球的获取

S1-1，离体动物眼球来源于动物屠宰场，眼球的摘取应在动物死亡4h内进行；

S1-2，采用剪刀或类似器械从眼眶进入，切断与眼球连接的组织，完整取处眼球，摘取眼球的过程中不能接触或损伤眼球组织及眼球表面的角膜；

S1-3，将摘取下的眼球完全浸泡于含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素、且4℃预冷的无菌 HBSS缓冲液，于7h内进行检测；

S2，离体角膜的制备

S2-1，离体角膜指健康动物离体眼球分离的角膜，无肉眼可见的损伤或病变；

S2-2，分离角膜前肉眼检查角膜完整性，丢弃有划痕、色素沉着、白班、混浊、机械损伤或异常者；

S2-3，源于牛眼球的角膜直接分离，猪眼球应浸入含1％的聚维酮碘溶液2min，用无菌PBS冲洗，浸入含有0.1％庆大霉素的PBS 15min消毒后进行角膜分离操作；

S2-4，角膜分离应在洁净的环境下进行，紫外灯照射房间至少30min；

S2-5，角膜外周保留2-3mm巩膜，以手术刀做切口，环切下角膜，夹住巩膜，用镊子剥除角膜内皮的玻璃体和虹膜附属组织，操作中不得直接接触角膜上皮或内皮组织；

S2-6，将角膜内皮朝上置于无菌32±1℃预热HBSS缓冲液中清洗1-2次，去除附属残留组织；