[发明专利]能从个体细胞微创式提取蛋白的纳米针装置及其制作方法

说明书

技术领域

本发明属于提取细胞内蛋白的产品技术领域，特别涉及能从个体细胞微创式提取蛋白的纳米针装置。

背景技术

生物电子与生物信息领域近年发展迅速，它综合利用计算机技术、蛋白分析和基因测序等技术，理解生物分子如何调控细胞和生物体的活动，并被用于疾病预测和新药物开发。细胞内的蛋白分子是生物电子和生物信息领域的主要研究对象之一，它在调节细胞活动，维持细胞或机体功能等方面起着关键作用，对细胞的行为例如细胞分化、细胞分裂、细胞病变和衰老等都是至关重要。细胞内蛋白分子的表达是动态的过程，会随外部环境和细胞自身生命周期而改变。精确掌握细胞内蛋白的动态表达情况，是生物信息电子和生物信息领域发展所需要解决的热点问题。

目前已有一系列成熟的技术和仪器用于对溶液相里的蛋白分子进行分析，例如酶联免疫吸附测定法(简称ELISA)、蛋白质印迹法、质谱检测等方法。这些蛋白分析技术都依赖于首先从细胞内提取出蛋白分子。

理想状态下，从细胞内提取蛋白分子的方法应具备以下特征：

(1)提取出足够量的蛋白分子，以达到蛋白分析所要求的检测量或检测浓度；

(2)无损或微创性地提取细胞内蛋白，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；

(3)能在不同的时间点检测同个细胞的细胞内蛋白动态表达情况；

(4)同时对大量细胞进行蛋白提取并对不同个体细胞的蛋白分析具有区分性，而不单是测量群体细胞的平均状况。

(5)同时间对同个细胞内的多种蛋白进行提取分析，了解多种组分的蛋白的动态构成。

目前细胞内蛋白提取技术已取得重要发展，但尚缺同时满足以上要求的微创式细胞内蛋白提取技术。

从细胞内提取蛋白的方法有如下几种：

第一种，细胞裂解法。该方法是对细胞进行化学裂解或电裂解，随后把裂解液里溶解的细胞蛋白提纯，再用蛋白分析技术进行后续分析。例如Han实验室制备了微流控器件，能够对单细胞进行快速裂解和蛋白提取分析。

细胞裂解法的缺点是：裂解法直接杀死了细胞，只能在单一时间点对同个细胞进行蛋白分析，无法对同个细胞反复提取蛋白，动态监控细胞在不同时间点的蛋白表达情况。虽然可在不同时间点裂解和检测不同细胞得到某时间点细胞群体的蛋白平均表达情况，但由于细胞个体间存在差异性，无法准确得知同个细胞的蛋白动态表达。

第二种，使用具有光学性质的纳米材料进入细胞检测蛋白的方法，该种方法是通过使用具有光学性质的纳米材料或荧光分子，进入到细胞内与所需检测的蛋白产生作用发出光学响应(例如荧光共振能量转移等)，从而通过检测光学信号测量细胞内蛋白。例如Choi等制备荧光量子点检测细胞内蛋白。该种方法能成功地在不杀死细胞的前提下在活细胞内检测蛋白的表达，但纳米材料长期累积在细胞内容易引起细胞毒性影响正常功能，影响人体的健康。

第三种，利用微加工技术制作单根的纳米尺寸针头插破细胞膜直接检测细胞内物质的方法，该方法是通过纳米尺寸针头用于插破细胞膜直接检测细胞内物质，环境或电信号，或对细胞内物质进行提取分析。此方法的优点在于所使用的针头相比于细胞较为细小，在对细胞内物质的检测过程中不会影响细胞活性。例如Gogotsi实验室将细小的碳纳米管加装在玻璃吸管，利用微操作台操控碳纳米管针头刺破细胞膜探测细胞内环境和细胞器。除了使用实心针头，Vorholt实验室使用具有空心锥形针头的流体力显微镜，利用液压差在单细胞内提取细胞液并对其所含蛋白分子进行分析。

但是该种方法也存在以下缺点：单根空心纳米针头系统的设备和操作都比较复杂，只能依次对少数细胞逐个进行检测，操作不便。

第四种，实心空心纳米针头阵列检测细胞内蛋白分子的方法：为了对批量细胞进行检测，实心空心纳米针头阵列被用于插破细胞膜探测细胞内蛋白分子。大量的空心纳米针头规整排布于同一衬底上，能够对处于空心纳米针头阵列上方的多个细胞进行穿透并探测其内部环境。例如Park实验室在空心纳米针头表面连接特异性多肽。这些多肽能响应细胞内的细胞凋亡蛋白酶-3被切断，检测结果用质谱进行分析。

但该种方法也存在以下缺陷：由于空心纳米针头是实心的，需要事先在针表面连接好响应目标蛋白的特异性抗体或多肽，无法对含有多种复杂成份的细胞液进行直接提取。