[发明专利]一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe³⁺微球的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)芽胞杆菌培养及芽胞收集：取在–20℃下用50％甘油保存的巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180r min^-1培养过夜，将菌种活化；将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7d，使巨大芽胞杆菌转变为芽胞；收集平板上长出的巨大芽胞杆菌芽胞，用双蒸水清洗芽胞3次，重悬，保存在4℃冰箱中备用；

(2)芽胞处理：将收集到的巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，冰浴条件下超声处理5次，每次3min，每次超声间隔6min，超声输出强度为7–8，频率为20％–30％，超声后离心，用双蒸水清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80r min^-1振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，将芽胞重悬后，在121℃高压蒸汽下灭活30min，使芽胞失去活性，在4℃冰箱保存备用，即为芽胞储备液；

(3)芽胞吸附Fe³⁺离子：取0.5mL，即为芽胞干重为0.5mg的处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL的0.05mol L^-1的Fe³⁺离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散；将EP管放入摇床中140r min^-1振荡40min，离心去上清，用MOPS缓冲液清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe³⁺离子，即为巨大芽胞杆菌@Fe³⁺微球；

其中：

步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)按照如下方法配制：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10^-1g氯化钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至100mL；

步骤(3)中所述的1％胰蛋白酶溶液的配制：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中；

步骤(3)中所述的0.05mol L^-1的Fe³⁺溶液配制：称取0.0108g六水合三氯化铁溶于50mL去离子水中；

步骤(3)中MOPS缓冲液的配制：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中；调pH至6.0后定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，室温下避光保存。

2.如权利要求1所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe³⁺功能微球的方法，其特征在于：所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的保藏编号为CCTCC AB 92052。

3.如权利要求1所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe³⁺功能微球的方法，其特征在于：所述的Fe³⁺离子来源于六水合三氯化铁(FeCl₃.6H₂O)，其分子量为270.29。