[发明专利]一种外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用

说明书

本发明公开了一种外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用。本发明从海洋细菌微泡菌ALW1中克隆得到新的褐藻胶裂解酶基因algl17，大小2220 bp，编码739个氨基酸，蛋白质分类归为PL‑17家族。将该基因在E.coli中进行表达和纯化，得到重组AlgL17，分子量大小约为85 kDa。该酶对海藻酸钠、D‑聚甘露糖醛酸（polyM）和褐藻胶寡糖具有活性，而对L‑聚古罗糖醛酸（polyG）具有较低活性，表明该重组酶是polyM特异性寡褐藻胶裂解酶。重组AlgL17可作用于海藻酸钠，产生4‑脱氧‑L‑赤型‑5‑己糖糖醛酸（DEH），表明该酶是外切型褐藻胶裂解酶。该重组酶能直接降解海带，产生还原糖。本发明成功地构建了含上述新型褐藻胶裂解酶基因的重组载体，实现了异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程的技术领域，尤其涉及一种外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用。

背景技术

我国海藻资源丰富。褐藻是一种重要的经济海藻，代表植物包括海带、鹿角菜和马尾菜等。褐藻含 有褐藻胶、褐藻淀粉和褐藻糖胶等多糖，占脱脂褐藻干重的40％～80％，其中褐藻胶含量最为丰富。褐 藻胶是由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸两种糖醛酸单体通过β-1,4糖苷键连接形 成的线性高分子聚合物，广泛应用于食品、医药、化学工业等领域中。褐藻胶在褐藻的细胞壁和细胞内 基质中能够大量合成，也可以由一些特定细菌产生。近年来，以褐藻为原料生产乙醇成为藻类生物燃料 研究的热点。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应裂解褐藻胶的糖苷键。该酶可作为内切型，切割多糖，也可作为外切 型，切割褐藻胶或褐藻胶寡糖末端。利用褐藻胶裂解酶生产褐藻胶寡糖，具有高效、降解条件温和、水 解产物不易被破坏、回收工序简单、不污染环境等优点，为褐藻寡糖在功能性食品、多功能化妆品、新 产品药物等方面的研究与应用提供了新的手段。除了用于制备褐藻胶寡糖，褐藻胶裂解酶还应用于治疗 纤维化囊肿、制备原生质体、从褐藻中提取生物活性物质、分析褐藻胶结构、生产生物能源等中。

褐藻胶裂解酶主要来源于多种微生物、海洋藻类、海洋软体动物和棘皮动物等体内。本发明人研究 和设计了一个来自微泡菌ALW1(Microbulbifer sp.ALW1)的外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用，本 案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用，该酶可用于产生单糖和寡糖，可 应用于食品、医药、化学工业、能源等领域中。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种编码外切型褐藻胶裂解酶AlgL17的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小为2220 bp。

一种外切型褐藻胶裂解酶AlgL17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该蛋白编码739个氨基酸残 基。

一种褐藻胶裂解酶表达载体，含有所述的外切型褐藻胶裂解酶AlgL17基因的表达载体 pET-28a-algl17。

一种褐藻胶裂解酶的制备方法，包括采用所述的含有褐藻胶裂解酶基因的表达载体转化寄主细胞， 培养转化体，从培养物中获得重组褐藻胶裂解酶。当然，也可将褐藻胶裂解酶AlgL17基因转染到合适 的真核生物宿主中，包括酵母及哺乳动物细胞等。

作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为大肠杆菌。

作为实施例的优选方式，包括采用所述的含有褐藻胶裂解酶基因的表达载体转化至寄主细胞大肠杆 菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组褐藻胶裂解酶。

作为实施例的优选方式，所述的IPTG终浓度为0.1mmol/L，诱导温度为18℃。