[发明专利]编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子及其重组细胞株

说明书

本发明提供了一种编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种包含本发明的DNA分子的表达载体和用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株。本发明的提供的编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子经过优化，更有利于哺乳动物细胞表达。本发明提供的表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，本发明还涉及包含该DNA分子的载体以及其重组细胞株。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plaminogen activator，tPA)由血管内皮细胞合成并分泌的一种糖蛋白，是血液内纤溶系统的生理性激活剂。在血栓形成时，能特异与血栓中的纤维蛋白结合，并与纤溶酶原形成三元复合物，在血栓处激活纤溶酶原，达到局部溶栓的效果。基于这一特性，美国Genentech公司开发了重组人tPA并于1987年上市，通用名为阿替普酶(Actilyse)。作为一种高效特异的溶血栓药，阿替普酶用于心肌梗死、脑血栓等血栓性疾病的抢救和治疗。阿替普酶采用CHO细胞重组表达，具有与天然tPA相同的生物学活性，对血栓中的纤维蛋白有很高的亲和性，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等没有作用，这就避免了由于激活全身纤溶系统所带来的潜在出血危险。重组表达的阿替普酶与天然tPA序列一致，临床应用不会产生免疫反应等副作用。因此，疗效好、安全性高、溶栓后再凝趋势弱及便于抢救等是该药的最大优点。

但是，阿替普酶在血液中可以被I型纤溶酶原激活剂抑制物快速、特异地结合，从而失去溶栓活性，也可以与肝细胞、血管内皮细胞上的特异性受体结合而被吞噬和从血液中清除。这一缺点使得其在血液中的半衰期非常短，仅3-6分钟，这也导致阿替普酶临床应用剂量大(最大剂量达90mg)、费用昂贵。为了改变这一缺陷，主要从两方面进行改善：一是延长半衰期，主要是通过构建tPA的突变体，增强其活性或者降低与I型纤溶酶原激活剂抑制物及受体的亲和力实现，如德国Boehringer Mannheim公司开发的瑞替普酶、美国Genentech公司的TNK酶、美国Bristol-Myers Squibb公司开发的mPA酶、日本Eisai公司开发的孟替普酶等。二是优化tPA的生产工艺，通过改变表达系统、简化纯化步骤等提高生产率。例如，中国发明专利CN1314490公开了在酵母菌中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂(htPA)及其活性测定方法。在获得htPA cDNA的基础上，对该基因5’端加以修饰，使其正确插入pPIC9载体的α因子信号肽序列下游，经转化构建阳性工程菌，然而酵母菌表达系统的糖基化形式与哺乳动物细胞存在一定的差异，这些差异将直接影响重组蛋白的活性、稳定性及免疫原性。

中国发明专利CN101085978公开了一种用于动物细胞灌流培养的过滤-沉降双结合灌流系统，通过改造灌流培养系统的方式提高CHO细胞密度和产量。中国发明专利CN101096655公开了一种采用CYTOPORE多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的方法，将TNK-TPA基因工程CHO细胞株加培养基重新悬浮后，使用CYTOPORE多孔微载体培养TNK-TPA基因工程细胞生产TNK-TPA。中国发明专利CN1786161将含天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂的样品过亲和层析柱，通过特异的仿生亲和分离材料提高tPA的纯化收率等。

以上的研究多侧重于培养和纯化工艺方面的改进，而上游工艺特别是表达细胞株的设计和优化却鲜有报道。然而，当前生产重组tPA及其突变体的方法涉及的环节众多，是一项复杂的系统工程，而对细胞株构建的过程，如启动子的选择、目的基因的序列、筛选标记的选择等进行深入研究，将更有效地提高tPA的生产效率、并进一步地降低生产成本和使用成本。

基于此，当前对大规模生产重组tPA的高效率、低成本的方法存在需求。

发明内容