[发明专利]一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，公开了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。本发明所述ITS序列具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，可用于鉴定铁皮石斛与其高度相似的伪品。同时提供了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的试剂盒。进一步建立了相关的PCR检测体系，为铁皮石斛药材鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种相似度较高的石斛药材中快速、准确地检测区分出铁皮石斛，该方法操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对铁皮石斛药材的检测，适于广泛的推广使用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及铁皮石斛的分子生物学检测，尤其是一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。

背景技术

石斛是我国名贵的中药材，始载于《神农本草经》，列为上品，性甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效。在《中国药典》2015年版一部收载的石斛和铁皮石斛为两种不同药材品种。其中，石斛为金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)、鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl.)、流苏石斛(Dendrobiumfimbriatum Hook.)的栽培品种及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。而另外一种石斛品种，铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛(Dendrobiumofficinale Kimura et Migo)。

由于铁皮石斛具有全面的滋阴补益作用和广泛的保健功效，铁皮石斛一直被视为石斛中的珍品，因此，2010年版及2015年版《中国药典》将铁皮石斛单列而区别于金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛。铁皮石斛含有的多糖、氨基酸、微量元素、菲类、联苄类、酚酸类和生物碱等类型的化学成分。现代药理研究表明，铁皮石斛增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用。

我国铁皮石斛的种植规模快速发展，成为所有药用石斛中种植面积最大的品种。据统计铁皮石斛种植面积已达5万多亩，主要分布在云南、浙江、广东和广西等地。但石斛属种类繁多，仅供药用的石斛属植物就有39种。而且遍布各地有很多的习用品以及混伪品，如金石斛属、石豆兰属、石仙桃属等多个种。由于石斛的近似种以及混伪品过多，特别是名贵药材铁皮石斛的伪品，需要针对石斛的基源和药材进行过深入的研究，鉴定铁皮石斛及其伪品。

传统的鉴定方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。铁皮石斛与石斛属内其它品种性状相似，形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学的研究深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、ISSR标记、AFLP技术等得到了广泛的应用，但它们也存在很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的揭示亲缘物种间的演化关系，但不稳定，受实验条件限制较大；ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合，但其稳定性较差，且对操作者要求高、花费大。

ITS2是近年来用于探讨植物种内、种间变异及近缘属间变异重要的分子标记技术之一。通过ITS2序列对比，已经可以将于铁皮石斛与其他混淆品种进行一个大概的区分。但还有众多与铁皮石斛类似的品种具有与铁皮石斛高度相似的ITS2基因序列，因此无法准确区分铁皮石斛与其伪品。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。本发明所述特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法能够实现对铁皮石斛与其伪品的快速、准确鉴定。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：