[发明专利]异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及异丁香酚单加氧酶的基因工程菌的构建及其生物催化技术领域，尤其涉及一种异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法。

背景技术

香草醛是世界上需求量最大的香料之一，广泛应用于食品、饮料、药品、化妆品等行业。目前市面上销售的香草醛分为天然香草醛和化学合成香草醛两种。其中，化学合成香草醛占市场份额的90％以上。研究发现，大剂量食用化学合成香草醛会造成头晕、呕吐、甚至损伤内脏。天然的香草醛提取自植物香荚兰的豆荚，因香荚兰的种植受到气候、产地、地方政策等的影响，每年产量不足20t，远不能满足人们的需求，且价格较为昂贵，每公斤价格是化学合成香草醛的几十倍。通过生物转化法获得的香草醛属于天然香草醛，其香味与天然香草醛无异，具有周期短、生产成本低等优点，是最具有发展前途的替代方法之一。异丁香酚来源广泛、价格低廉，是微生物转化法获得香草醛的理想前体物质。异丁香酚单加氧酶是高效催化异丁香酚获得香草醛的唯一关键酶。

生物催化生产香草醛需要解决的关键难题之一是如何高效制备异丁香酚单加氧酶。酶催化技术的核心是酶的高效生产、分离、制剂化和应用开发，但目前酶制剂的生产过程复杂、成本很高，已成为制约酶催化广泛应用的关键问题。近年来，人们发现通过将某些具有两亲性自组装功能的短肽(Self-assembly peptides，SAPs，一般在8-18个氨基酸残基)连接于可溶性酶的末端可以有效地诱导活性酶聚集体的生成。应用活性酶聚集体结合包埋法或交联酶聚集法(cross-linked enzyme aggregates，CLEA)制备固定化酶具有操作简单、活性高等优势，能够显著的降低蛋白质固定化成本，简化工艺，后续还可成功应用于目的蛋白的初步纯化，是实现活性酶制备工业放大和高通量纯化的基础目前，尚未有构建出异丁香酚单加氧酶活性聚集体的任何公开及报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种构建异丁香酚单加氧酶活性聚集体及其固定化的方法，包括以下步骤：

S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体的重组大肠杆菌：

将具有两亲性自组装功能的短肽18A(EWLKAFYEKVLEKLKELF)与目标基因异丁香酚单加氧酶连接，构建异丁香酚单加氧酶-18A活性聚集体，并在大肠杆菌中表达，获得重组大肠杆菌；

S2、使用构建的所述重组大肠杆菌生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体：

将构建的所述重组大肠杆菌进行培养优化、诱导，离心收集诱导后的菌体，破碎细胞以获得粗酶液，将所得粗酶液离心和/或过滤，得到沉淀即为异丁香酚单加氧酶活性聚集体。

优选地，步骤S1包括以下步骤：

S1-1、将菌株E.coli BL21(DE3)IEM和E.coli BL21(DE3)pET30a-LipA-18A进行培养，分别获得大肠杆菌E.coli BL21(DE3)IEM和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pET30a-LipA-18A；

S1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计四对PCR引物，包括上游引物A、下游引物B1、下游引物B2、下游引物B3和下游引物B4；其中上游引物A和下游引物B4为包含酶切位点的特异性引物；

S1-3、按照顺序分别使用四对PCR引物，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)IEM为第一次PCR模板进行PCR扩增，得到的PCR产物稀释1000倍后取1μL作为下一次PCR的模板；下一次的PCR均以上一次PCR产物为模板进行扩增，最终得到PCR产物目的基因异丁香酚单加氧酶，命名为IEM-1；

S1-4、对所述目的基因IEM-1进行纯化；

S1-5、从大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pET30a-LipA-18A中提取质粒pET30a-LipA-18A；

S1-6、分别对所述目的基因IEM-1与质粒pET30a-LipA-18A进行双酶切；

S1-7、将目的基因IEM-1和质粒pET30a-LipA-18A的双酶切产物进行核酸电泳，回收双酶切产物；

S1-8、将目的基因IEM-1和质粒pET30a-LipA-18A双酶切再回收后的产物进行连接，得到连接产物异丁香酚单加氧酶-18A活性聚集体，命名为pET30a-IEM-18A；