[发明专利]一种肿瘤组织块深低温冷冻方法

权利要求书

1.一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

一、冻存液的配制：

用DMEM将人血白蛋白冻干粉配制成质量浓度为10％～40％的人血白蛋白溶液，用DMEM将羟乙基淀粉配制成质量浓度为15％～25％的羟乙基淀粉溶液，用DMEM将乙二醇配制成质量浓度为20％～30％的乙二醇溶液，三种溶液分别用0.22μm滤器无菌条件下过滤备用；

然后将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为25：14：10：1比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用；

二、组织块的处理：

将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织2～3次，用手术剪剪碎至1～2mm³的块状，然后加入步骤一配好的冻存液重悬组织块，按每管1mL分装到冻存管中；

先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体为：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升温至-20℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃长期保存；

三、冻存肿瘤组织块复苏：

冻存12～24个月后，将冻存管从液氮中取出于37～38℃水浴快速解冻，冻存管内剩余1～2mm³冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4℃预冷DMEM后将解冻后的组织块加入离心管中，4℃，1500～2000rpm离心5～10min后弃上清，用含3％～10％人血白蛋白的PBS洗涤组织两次后重悬组织于PBS中。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为20％～30％的人血白蛋白溶液。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为18％的羟乙基淀粉溶液。

4.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为25％的乙二醇溶液。

5.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤三中用含5％人血白蛋白的PBS洗涤组织。