[发明专利]检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示：

FP引物：CCTATCGGCATAGGGGTCCTCCAAGTAGTTTG

TP引物：GTTCCCGGACTCCACCGTGCAGCTCATCAT

BP引物：GCAGCCGAAGGGCATGAGC

OP1引物：GCTGGGCATCTGCCTCAC

OP2引物：CCAGGTCGCGGTGCACC。

2.如权利要求1所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。

3.一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。

4.根据权利要求3所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts错配结合蛋白。

6.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、16mM MgSO₄，0.2％20。

7.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有检测人EGFR基因T790M突变点基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含人EGFR基因T790M突变点基因片段的水或其他溶剂。

8.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为1/50000原液稀释的Green I。

9.一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测方法，包括如下步骤：

(1)待检样品DNA的提取；

(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应40min；该智能恒温扩增反应体系中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组；

(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。

10.根据权利要求9所述的检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增检测方法，其特征在于，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I 0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL DNA步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。