[发明专利]葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于葡萄糖激酶应用技术领域，具体涉及一种葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。

背景技术

肥胖和2型糖尿病的新药研制一直是科研和开发领域的热点，其中具有代谢调控作用的生物活性蛋白类物质也是中国研发公司的开发重点。研究发现，成纤维细胞生长因子21(FGF21)重组蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、减轻体重、降低血糖、显著减轻2型糖尿病及其并发症。在药物研发中，一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物优劣的关键，因此，建立一个客观评价FGF21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测体系对于FGF21研发十分重要。

目前，脂肪细胞的葡萄糖摄取实验室测定普遍采用的FGF21重组蛋白活性检测方法，该方法通过在培养液中加入2-脱氧葡萄糖来测定，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖不能进入后续代谢步骤，从而在细胞中聚集，直接成比例地反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法虽然可以检测FGF21活性，但是有以下不足之处：一是该方法使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，对于实验防护和环境保护要求较高，而且该方法使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，价格昂贵，不利于高通量筛选使用；二是2-脱氧葡萄糖摄取受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此，如果发明新的FGF21重组蛋白功能检测体系来弥补葡萄糖摄取实验的不足，并且能够做到更加简便、可靠，那这对于客观评价FGF21重组蛋白效果具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组FGF21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是，葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。

本发明的特征还在于，

葡萄糖激酶的基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为：当人重组FGF21蛋白的添加浓度c≥4-6ng/ml时，葡萄糖激酶基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而减少。

本发明的另一个技术方案是，用于判断人重组FGF21蛋白活性的葡萄糖激酶，葡萄糖激酶的引物序列为：

上游引物：5’-CAC CCA ACT GCG AAA TCA CC-3’；

下游引物：5’-CAT TTG TGG GGT GTG GAG TC-3’。

本发明的特征还在于，

葡萄糖激酶的基因表达水平被人重组FGF21蛋白下调，且呈剂量依赖性下降。

葡萄糖激酶为脂肪细胞内的葡萄糖激酶。

本发明的有益效果是：本发明通过人重组FGF21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂肪细胞的基因表达，从而确定脂肪细胞葡萄糖激酶表达水平可成为FGF21活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；

图2是本发明定量PCR观察葡萄糖激酶和beta-actin基因的扩增曲线图；

图3是本发明PCR产物的溶解曲线；

图4是本发明人重组FGF21对葡萄糖激酶基因表达的影响的柱状图；

图5是本发明人重组FGF21对葡萄糖激酶基因表达的量效关系图；

图6是本发明人重组FGF21受体抑制剂对FGF21作用的抑制效应的柱状图。

具体实施方式

本发明葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、细胞培养和处理：小鼠前体脂肪细胞种植于12孔培养板中，在37℃孵箱培养，所用培养液为普通培养液即DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液，诱导培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3IU/ml胰岛素、20μmol/L地塞米松和20μmol/L罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液，胰岛素培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3IU/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于FGF21处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。