[发明专利]经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种经干扰序列修饰的TGF‑β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用，本发明通过携带shRNA的慢病毒载体缄默外泌体来源细胞的TGF‑β1表达，从而生产纯化出TGF‑β1含量下调的白血病细胞源性外泌体，即LEX_TGF‑β1si。将改造后的白血病细胞源性外泌体致敏树突状细胞，制备成DC_{LEX‑TGF‑β1si}疫苗。体外与动物模型实验显示，本发明所改造的疫苗可产生更强大特异性抗白血病免疫反应。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

白血病患者治疗后复发是影响患者长期生存的主要因素，其根本原因是治疗后体内残留的白血病细胞所致。而传统手段则主要依靠大剂量巩固化疗和异基因造血干细胞移植来清除缓解期患者体内残留的白血病细胞，其中移植物中异基因淋巴细胞的抗白血病作用至关重要，但是这种非特异性的免疫效应常常伴有严重移植物抗宿主病，是目前造血干细胞移植的主要死亡原因。免疫治疗可特异性清除白血病患者治疗后体内残留白血病细胞，减少和预防白血病复发，延长患者的生存期，改善白血病的预后。数个临床研究表明抗肿瘤疫苗对白血病有一定的疗效，是白血病治疗的一个很有希望的发展方向。探寻更有针对性，操作简便，适合临床应用的白血病细胞特异性免疫治疗一直是白血病等恶性血液肿瘤治疗研究的热点。

外泌体是直径为40-100nm，由真核细胞释放的，含有多种细胞膜分子以及相关蛋白的小囊泡。多种类型细胞尤其是造血系统来源的细胞均能释放EXO。其中包括抗原提呈细胞如树突状细胞(dendritic cells,DCs)、淋巴细胞、肥大细胞、肠上皮细胞以及多种肿瘤细胞等。近年来有研究证实肿瘤细胞来源的EXO(tumor cell-derived exosomes,TEX)负载有肿瘤细胞相关抗原，可被树突状细胞吞噬，并能诱导肿瘤特异性的CTL反应，因为有望成为理想的抗肿瘤疫苗来源。Alter等报道浆细胞瘤源性的外泌体疫苗可保护80％小鼠免受肿瘤攻击，并可有效抑制肿瘤生长。Yao等报道白血病细胞同样可以释放外泌体(leukemiacell-derived exosome,LEX)，且可被DC摄取.LEX靶向结合的DC细胞可显著提高荷瘤小鼠的生存率，并减缓肿瘤生长。因此以白血病源性外泌体为基础的抗白血病疫苗可有望安全有效地清除白血病缓解期患者体内残余的微小残留病灶。

在一项I期临床试验中，Dai等分离患者恶性腹水的外泌体作为特异性抗肿瘤疫苗来源，单独应用外泌体疫苗或联合免疫佐剂GM-CSF治疗III/IV期肠癌患者。结果显示，未经修饰的肿瘤外泌体疫苗虽表现出良好的安全性，并可在体外诱导DTH反应。然而大部分患者却未从治疗中获益。未经修饰的肿瘤源性外泌体虽可诱导一定的抗原特异性免疫反应，然而其免疫原性相对较弱，临床疗效仍不乐观。更为重要的是，有研究显示，肿瘤细胞释放的外泌体(tumor cell-derived exosomes,TEX)可能对宿主免疫系统有抑制效应，甚至有促进肿瘤细胞生长的作用。

由于未经修饰的TEX疫苗抗肿瘤效应有限，因此优化以TEX为基础的肿瘤疫苗，提高其免疫原性从而诱导更强大的抗肿瘤特异性免疫应当是提其临床应用价值的关键。研究发现，TEX中富集有诸如Fas-L、TGF-β1，PD-1L等免疫抑制因子。其中TGF-β1是其中最为重要的免疫抑制因子，其可通过阻碍DC细胞成熟，抑制T细胞增殖、促进CD8⁺T细胞凋亡，诱导调节性T细胞增殖、下调T细胞和NK细胞的NKG2D受体等方式显著削弱TEX疫苗的抗肿瘤效应。因此，为了提高外泌体疫苗的免疫效力，本发明通过在白血病细胞中采用基因修饰手段缄默其TGF-β1的表达水平，从而下调白血病细胞来源的外泌体(LEX)负载的TGF-β1含量。

发明内容