[发明专利]一种热稳定性提高的醇脱氢酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的醇脱氢酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的醇脱氢酶突变体为以SEQ ID NO.1所示野生型醇脱氢酶为基础进行了如下突变后的突变体中的一种：第100位的T突变为R或K的单突变体T100R、T100K；第148位的S突变为I、V或L的单突变体S148I、S148V、S148L；第100位的T突变为R且第148位的S突变为I、V或L的双突变体；第100位的T突变为K且第148位的S突变为I、V或L的双突变体。这些突变体的热稳定性相对于野生型有了更进一步的提升，更加适合工业化的生产需求，具有更加广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的醇脱氢酶突变体。

背景技术

醇脱氢酶种类繁多并且来源广泛，作为一种生物催化剂，很早就被投入到工业生产当中(Tufvesson,P.r.et al.Org.Process.Res.Dev.，2010，15：266-274)。由于其绿色、经济、可持续、催化产物光学纯度高、转化率高等特性，近年来受到了广泛的关注。醇脱氢酶通常能通过辅酶(如NADH或NADPH等)提供氢或电子对一系列的羰基化合物(如芳基酮、脂肪酮、醌和醛等)进行催化，生成相应的手性醇。由于手性醇是药品、医药中间体等合成的重要组成部分，因此，对羰基还原酶的研究日益增多，以期望开发出高催化活性，高稳定性以及高选择性等优异催化性能的醇脱氢酶。目前，已经有很多羰基还原酶被克隆出来，并用于光学活性手性醇的不对称合成反应中(Barbieri,C.et al.Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic，2001，11：415-421)。

手性醇由于手性中心接有活泼的“-OH”这一官能团，得以在生物体内参与各种反应，因此它在各类药物以及其他各类手性产品合成时所需手性中间体中占有重要的地位(Bommarius,A.S.et al.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，1998，5：1-11)。羟基作为最重要的官能团之一，它不仅可以容易地转化成许多其他的官能团，并且它是最容易通过生物催化来获得光学纯形式的(M.Truppo Comprehensive Organic Synthesis(2nd Edition)，2014，15：317-327)。许多ADHs(醇脱氢酶)和KRs(酮基还原酶)具有非常好的选择性并且可以接受不同的酮基底物以产生手性羟基化合物；通过利用ADHs和KRs，如今已经有一百多种重要的羟基中间体被商业化了；事实上，在已报告的工业生物转化中约30％采用了ADHs和KRs(M.T.Reetz J.Am.Chem.Soc.，2013,135:12480-12496；M.TruppoComprehensive Organic Synthesis(2nd Edition)，2014，15：317-327；A.J.J.Straathofet al.Curr.Opin.Biotech.，2002，13：548-556)。这些中间体已经用于制造许多重磅药物，如氯吡格雷(2011年度销售额6.5亿美元)和立普妥(2011年销售额7.4亿美元)。这说明醇脱氢酶在工业生产应用中无疑是一种非常重要的酶。

但在非生理条件下，酶通常具有较低的稳定性，容易导致失活(R.Fernandez-Lafuente,Enzyme Microb.Tech.，2009，45：405-418)。酶的这种不稳定性的缺点是阻碍其在工业和医药应用的最重要因素之一，对蛋白稳定性的改进长期以来一直是一个重点和难点(H.P.Modarresac et al.RSC Adv.，2016，6：115252-115270)。因此获得热稳定性得到提高的醇脱氢酶具有重要的工业应用价值。