[发明专利]一种大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌鉴定技术领域，特别涉及一种新型的大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒，以及该试剂盒的鉴定方法。

背景技术

肠道产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起犊牛腹泻病的最主要细菌病原，其毒素能提高宿主肠道上皮细胞内环状AMP或GMP，使电解质液分泌增多，从而导致腹泻发生。新生犊牛在出生后的最初4d内对ETEC高度敏感，如果感染就会发展为水样腹泻。迄今为止，从犊牛分离到的肠致病性大肠杆菌已发现的纤毛抗原有K88、K99、987p、F41等，其中以K99和F41最为常见。针对不同菌毛抗原类型的大肠杆菌，需要采用不同的预防和治疗方法。传统大肠杆菌菌毛类型的鉴定方法主要采用快速凝集方法，需要将菌毛抗原提取，再与特定菌毛抗体凝集，根据凝集结果进行判定。该方法操作步骤多，过程繁琐，且菌毛抗体来源不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒，当所鉴定的大肠杆菌样品的菌毛抗原类型为K99时，通过PCR扩增后，在电泳结果中可得到特异性阳性条带；当所鉴定的大肠杆菌样品的菌毛抗原类型不为K99时，通过PCR扩增后，在电泳结果中无法得到特异性阳性条带，从而起到鉴定大肠杆菌K99菌毛抗原的目的。

本发明所采取的技术方案是：

一种大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增大肠杆菌K99菌毛抗原的引物对，所述引物对包括上游引物5’-CCAATGCTTCTGCGAATACAGG(SEQ ID NO.1)-3’，以及下游引物5’-CCGGGCGCTGGTTTTAGTTT(SEQ ID NO.2)-3’。所述试剂盒还包括PCR预混液、双蒸水、阳性对照模板和阴性对照模板。所述的PCR预混液(Premix)为商售的试剂产品，内含DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture等，使用时参照使用说明书进行；所述阳性对照模板为大肠杆菌K99标准菌株的DNA模板；所述阴性对照模板仅含有双蒸水；所述的使用说明书为指导实验者用所述试剂盒进行大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定的操作指南。

一种大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定方法，包括以下步骤：

a)挑取大肠杆菌样品的单菌落，置入装有双蒸水的离心管中，在95～100℃水中热变性10min，然后在8000rpm条件下离心5min，取上清液作为DNA模板；

b)分别往样品反应管中加入DNA模板、上游引物、下游引物、PCR预混液、双蒸水；

c)将反应管置于PCR仪器进行扩增反应，反应条件设置为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环，最后72℃延伸10min，在12～25℃时终止反应；

d)将上述反应后PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为130V，18min，根据凝胶上的条带进行结果判定。

其中，步骤c前还包括步骤：b’)向阳性对照反应管中加入阳性对照模板、上游引物、下游引物、PCR预混液、双蒸水；向阴性对照反应管中加入阴性对照模板、上游引物、下游引物、PCR预混液、双蒸水。

本发明的有益效果是：提供一种新的大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒，用于大肠杆菌K99菌毛抗原的鉴定，操作简单，鉴定时间快，试验材料易于获取。

具体实施方式

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一种大肠杆菌K99菌毛抗原PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增大肠杆菌K99菌毛抗原的引物对，所述引物对包括上游引物5’-CCAATGCTTCTGCGAATACAGG(SEQ ID NO.1)-3’，以及下游引物5’-CCGGGCGCTGGTTTTAGTTT(SEQ ID NO.2)-3’。所述试剂盒还包括PCR预混液、双蒸水、阳性对照模板和阴性对照模板。所述的PCR预混液(Premix)为商售的试剂产品，内含DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture等，使用时参照使用说明书进行；所述阳性对照模板为大肠杆菌K99标准菌株的DNA模板；所述阴性对照模板仅含有双蒸水

本发明试剂盒的具体使用方法：