[发明专利]一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法

权利要求书

1.一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子，采用磁珠对所述扩增子进行纯化，所述多重PCR引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重PCR引物的5’端为通用序列，所述多重PCR引物5’端通用序列的长度在24nt以上，且通用序列3’端存在NGG的碱基排列，通用序列能够被Cas9/gRNA系统中的gRNA互补配对，使用多种不同的通用序列；

S2：采用Cas9蛋白酶，并加入与多重PCR引物5’端通用序列互补配对的gRNA，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体，采用磁珠对所述扩增子进行纯化，gRNA的5’端与所述多重PCR引物的5’端的通用序列互补配对；gRNA加入到反应体系中的种类与多重PCR引物使用的通用序列种类一致；

S3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，对扩增子的3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头连接到扩增子的5’端和3’端；

S4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白酶为切割双链、切割单链或识别不同PAM结构的Cas9蛋白酶的变体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，gRNA来自化学合成。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，gRNA来自体外转录。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用T7DNA聚合酶转录 gRNA，gRNA的5’端添加GG序列。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用T4DNA聚合酶进行转录，在gRNA的5’端添加X碱基，增加T4DNA聚合酶的识别和转录。