[发明专利]一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用

权利要求书

1.一种重组天冬氨酸蛋白酶，其特征在于：所述重组天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.如权利要求2所述蛋白质的编码基因，其特征在于：所述编码基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由权利要求2所述的编码基因连接至巴斯德毕赤酵母GS115表达载体pPIC9K构建而成。

5.一种重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是将权利要求4所述的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中获得的。

6.一种制备如权利要求1所述重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)种子液培养：将重组菌株接种于YPD培养基中，在30℃、220rpm条件下培养24h，得到种子液；

2)分批发酵培养：将步骤1)的种子液以10％接种量接种于5L发酵罐中的分批发酵培养基中进行培养，分批发酵培养基的装液量为20-30％，搅拌转速为500-600rpm，通气量为1.0-2.0vvm，用25％氨水调节pH，控制pH 4.0-6.0，培养温度为28-30℃；

3)甘油流加培养：当分批发酵培养基中的甘油耗尽溶氧反弹时以15-20mL/h/L的流速补加质量浓度为50％的甘油，待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿0.5-1.5h，开始流加诱导培养基；

4)甲醇诱导培养：将搅拌转速升高至800-900rpm，诱导培养基采用分段流加方式：0-8h时流速为3.6mL/h/L，8h时流速为10.9mL/h/L，诱导重组天冬氨酸蛋白酶表达，得到发酵液；

5)离心和纯化：将所述发酵液依次进行离心和纯化。

7.如权利要求6所述制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述分批发酵培养基包括：CaSO₄ 0.93g，K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7mL，PTM₁4.35mL/L；步骤3)中补加的甘油中含12mL/L PTM₁，所述诱导培养基是含有12mL/L PTM₁的100％甲醇诱导培养基。

8.如权利要求6所述的制备重组天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述离心和纯化包括以下步骤：

(1)将发酵液在10000×g条件下冷冻离心10min，取上清液，所述上清液为含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液；

(2)将步骤(1)中含有重组天冬氨酸蛋白酶的溶液依次进行QSFF强阴离子交换层析和S-100凝胶过滤层析，得到纯化后的重组天冬氨酸蛋白酶。

9.权利要求1所述重组天冬氨酸蛋白酶在嫩化猪肉和水解动物及植物蛋白制备多肽的应用。