[发明专利]一种分析IC50剂量δ-生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法

说明书

本发明公开了一种基于¹H NMR代谢组学方法分析IC₅₀剂量δ‑生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法，包括以下方法：(1)确定δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC₅₀剂量；(2)细胞萃取液的制备；(3)核磁共振预处理；(4)¹H核磁共振检测；(5)差异性代谢物的筛选；(6)代谢通路分析。本发明应用氢谱核磁共振技术结合代谢组学方法，研究了不同细胞差异性代谢物以及代谢通路的影响，提供了一种研究δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞的亚毒性的分析方法。

技术领域

本发明涉及基于¹H NMR代谢组学方法分析IC₅₀剂量δ-生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法，属于细胞水平的代谢组学分析。

背景技术

维生素E的生物活性：

维生素E是维持人体正常的新陈代谢和各项生理功能所必须的分子。并且，维生素E 人体自身无法生成，需要通过食物从外界摄取。富含维生素E的食物包括杏仁、榛子、大豆以及鳄梨等。维生素E又名生育酚，根据甲基在色满环的位置以及数量，可分为以下八 种α-TOH、β-TOH、γ-TOH、δ-TOH四种生育酚；α-TT、β-TT、γ-TT、δ-TT四种生育三烯 酚。其中α-TOH生物活性最大，γ-TOH和δ-TOH的活性分别仅占α-型的10％和1％；然而， 抗氧化能力δ-TOH最强，是α-TOH抗氧化能力的100倍。维生素E具有多种生理功能，其 中包括抗氧化，抗衰老，治疗冻伤，保护血管，保护细胞膜，甚至是信号转导和基因表达 等。维生素E还能通过调控信号通路缓解肥胖症以及其代谢并发症，影响的通路包括Wnt， JAK-Stat(the JanusKinase-signal transducer and activator of transcription)，PI3K(thephosphatidylinositol 3’-kinase)/Akt/mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路，而这些 信号通路许多都与肿瘤活性相关。最近有研究人员发现γ-TOH能够通过抑制有氧糖酵解抑 制肿瘤发生。并且有报道称，维生素E的不同亚型在体内和体外具有不同的代谢途径。根 据WHO(World Health Organization)数据表明正常成年人对维生素E(δ-tocopherol)的推 荐摄入量(Recommended Nutrient Intakes,RNIs)为每天10mg，可耐受最高摄入量(Tolerable Upper Intake Level,UL)为1000mg。纳米银对小鼠肝原代细胞产生的毒性可以通过一定剂 量的维生素E保护。在对小鼠不同癌变时期乳腺上皮细胞的毒性实验中发现，癌前病变时 期，肿瘤时期和恶性肿瘤时期的乳腺上皮细胞δ-TOH的IC₅₀剂量分别为55μM，47μM和 23μM。很早就有研究表明，维生素E能够修饰由于某些化疗药物引起的白细胞减少，从而 对癌症的化疗治疗起到辅助作用。不同亚型的生育酚对巨噬细胞RAW264.7的IC₅₀浓度也 不尽相同，结果显示δ-TOH对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞活性影响大于α-TOH的影响。 过量的维生素E对细胞会造成怎样代谢组学方面的影响，很少有报道研究。

代谢组学的相关应用：

目前代谢组学已经在各个领域有广泛而成熟的应用，其中包括癌症治疗和中药成分研 究等。这些都是基于代谢水平上分子定性以及定量的研究。伴随着代谢组学的发展，癌细 胞与正常细胞的差异性也逐步确定。最近有研究表明，造血干细胞转移治疗癌症的方式可 能导致骨髓增生异常综合症或急性髓细胞样白血病，这一过程包括丙氨酸和天冬氨酸代谢、 二羧酸代谢、苯丙氨酸代谢、柠檬酸循环以及氨酰tRNA生物合成等代谢通路的调控。与 此同时，对于RAW264.7细胞系代谢组学方面的研究比K562细胞系相对要少。大部分对巨 噬细胞代谢组学方向的研究侧重于δ-TOH和γ-TOH对其生物活性的影响。