[发明专利]一种鉴别烟曲霉的探针、引物和基因芯片

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于鉴别烟曲霉的专用引物、探针和基因芯片。

背景技术

乳制品是一种营养丰富，容易被消化和吸收的天然食品，随着人们生活水平的提高，已经成为生活中常见的食品。但是营养丰富的乳制品也是各种微生物青睐的温床，这导致乳制品的货架期非常有限，比如经巴氏灭菌的乳制品保质期一般不超过7天（巴氏鲜奶占全球液态奶70%的市场份额），近些年市场占有量越来越大的发酵酸奶，其保质期一般也只有21天。

另一方面，国家《食品安全法》和《企业生产乳制品许可条件审查细则（2010版）》中明确要求企业必须对所生产、加工的乳制品进行出厂前微生物检验，包括5种指示菌和5种致病菌的检测。目前乳制品企业基本都是采用传统的平板培养法来检测微生物，这种方法的检测周期一般在3-4天左右，但是有些致病菌不能仅凭菌落形态来判定，需要配合其他生化反应试验做进一步鉴定，这无疑又增加了检测周期。因此，较长的检测周期（完成国标要求检测的10种微生物需要5-6天）和较短乳制品保质期（营养物质没有被破坏的巴氏灭菌乳制品的货架期只有7天）之间形成了矛盾，这一矛盾已成为制约乳制品企业发展的重要瓶颈，也成为制约市场终端能获取到营养最全面乳制品的重要因素。

基因芯片是DNA识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多个物种的多个DNA条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还大大缩短了检测周期，即利用基因芯片可以在短时间内对多种微生物类型进行检测。

为了解决乳制品中微生物检测所存在的上述问题，本发明研发了一种利用生物技术对烟曲霉进行检测的技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟曲霉特异性ITS分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的烟曲霉鉴别方法。

本发明的另一个目的是提供所述鉴别方法使用的专用探针和引物。

本发明采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了烟曲霉ITS DNA片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别烟曲霉的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别烟曲霉的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。

为实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的烟曲霉ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于扩增所述ITS特异性分子标记的引物，以及一种具有SEQ ID NO.7所述核苷酸序列的、用于检测所述ITS特异性分子标记的核酸探针。

更具体地，本发明是在引物1的5'端作为修饰位点，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针：

引物1: 5’ cy3—CTGCGGAAGGATCATTACCGAG—3’。

引物2： 5’—TCCTCTCCTGGCCTATTGATATG—3’。

核苷探针：5’NH₃—TTTTTTTTTTGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAG—3’。

本发明还提供了一种用于检测烟曲霉的基因芯片。本发明所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有，在所述基因芯片上固定有SEQ ID NO.7所述的核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。

本发明也提供了一种用于鉴别烟曲霉的装置，所述的装置为试剂盒，在所述试剂盒中至少包含有上述的烟曲霉检测用基因芯片或核酸探针，用于扩增本发明所述烟曲霉ITS特异性分子标记的专用引物和PCR扩增试剂，以及其他必要的相关试剂。

最后，本发明提供了一种鉴别烟曲霉的方法，本发明所述方法是利用上述烟曲霉ITS特异性分子标记对烟曲霉进行鉴定，利用PCR方法获得的烟曲霉扩增产物中应包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具体地，本发明所述鉴别烟曲霉的方法包括：

a) 提取待检测样本的基因组总DNA；

b) 以权利要求2所述引物对所述提取的总DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

c) 将所述PCR扩增产物与权利要求3所述的核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出所述待检测样本中是否含有烟曲霉。

进一步地，本发明所提供的烟曲霉abrⅡ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。