[发明专利]基于DNA的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于DNA的融合基因定量测序建库方法，步骤包括：1)基因组DNA片段化；2)DNA片段分选；3)单向特异性PCR扩增，获得带融合位点的扩增产物；4)在扩增产物序列的3’端连接单链通用文库接头序列；5)通用PCR扩增，富集融合基因区域片段，经纯化、定量，获得测序文库。本发明还公开了通过上述方法构建DNA文库进行融合基因测序检测的方法、该方法的用途，以及用于上述建库方法的融合基因单向特异性引物组。本发明通过单向特异性扩增DNA片段，捕获融合序列，再通过富集获得NGS测序用DNA文库，不仅提高了捕获的有效数据的比例，而且加快了建库和检测的速度，适合用于FFPE样本或液态活检。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及融合基因的测序检测，更具体地说，是涉及融合基因的DNA测序文库的制备，以及使用该DNA测序文库进行融合基因的高通量测序检测的方法。

背景技术

自20世纪80年代早期第一个融合基因(BCR/ABL1)被检测证实，融合基因已成为多个癌种的重要标志，例如：BCR/ABL1用于检测慢性骨髓性白血病；EML4/ALK用于检测恶性肺腺癌；TMPRSS2/ERG用于检测前列腺癌，等等。

21世纪开始，随着靶向药物的兴起，癌症治疗药物，尤其非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗药物，也开始使用融合基因所在的代谢通路。例如，2011年克唑替尼获得FDA许可用于ALK和ROS1基因融合的治疗；2015年艾乐替尼获得FDA许可用于ALK基因融合的治疗；索拉非尼和舒尼替尼获得RET基因融合的治疗许可。

在恶性肿瘤精准检测及个性化治疗概念被提出的今天，为了避免药物禁忌和耐受引起无效治疗，耽误宝贵的治疗时间，对于融合基因的有效特异检测成为临床医师给药的重要依据。早期的融合基因检测是在传统组织活检的基础上，采用荧光原位杂交、染色体条带分析以及RT-PCR分析技术来确认患者的肿瘤细胞是否发生了特定基因的基因融合。但是这些早期的细胞学及分子生物学技术对于融合基因的检测存在以下缺陷：1)检测时间久；2)假阳性率偏高；3)检测技术要求高，需要熟练有经验的检测人员，不利于标准化；4)在融合基因基因型细胞在癌组织中含量少的情况下，无法有效检出。随着NGS(高通量测序)技术的日益成熟，并全面进入临床基因检测领域，上述问题得到了有效解决。NGS检测技术具有灵敏度、特异性高，检测样本DNA需要量少，以及技术成熟、操作简便快速等一系列优点，在技术应用成本降低和通量不断增高的发展背景下，NGS技术成为融合基因检测的主流平台。

对于用测序或PCR方法检测融合基因，最为直接的方式是提取组织样本的RNA，通过反转录技术合成cDNA，捕获发生融合的外显子来分析完成。这样的方式是基于在基因组DNA层次，两个基因的融合点都发生融合的外显子序列间的内含子序列区域，而这个区域可能1kb，即使是读长较长的一代测序技术，也无法有效覆盖(NGS测序技术的读长一般在100-400bp)，无法直接分析融合的内含子区域；有些基因融合的融合点的位置仅仅在COSMIC数据库中有报导的就超过20个，无法确认融合位置的位置样本，也不可能通过特异PCR来富集融合位置的序列用于测序，而发生剪切后的成熟融合基因RNA的两侧序列则是已知的，可以通过PCR扩增富集长度小于200bp的序列，用于NGS高通量测序。基于以上原因，目前主流的融合基因测序检测技术是基于RNA的。但是，随着液态活检概念的引入及其优势性，基于RNA的融合基因检测方法突显了其局限性。

液态活检技术，是指仅提取患者的血浆或尿液中游离的肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)，通过基因捕获技术来快速检测肿瘤细胞基因型。在肿瘤细胞的生活周期中，会发生细胞死亡(发生的多种原因，此处不再赘述)，从而将内部核酸物质释放出来，并进入循环系统或排泄系统，当然这里也存在健康细胞的核酸，常规情况下每毫升血浆中游离DNA的得率是5-20ng，这样少量的游离DNA中，ctDNA的含量可能只有0.1-5％，而正因为高灵敏的NGS技术的应用，使检测ctDNA成为可能。可以看到液态活检技术相比传统组织活检具有多种优势：1)对患者侵害小；2)可多次取样监测；3)无需对取样进行病理区分。因此，各种肿瘤细胞的检测技术都纷纷改进，以适用于液态活检。