[发明专利]一种低值鱼抗菌肽的加工方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌肽加工领域，尤其是涉及一种低值鱼抗菌肽的加工方法。

技术背景

抗菌肽是一类具有抗菌作用的小分子多肽，一般由12-15个氨基酸组成，抗菌肽因其优良的抗菌特性减少了传染病的发病率，成为抗生素的理想替代品，目前已从自然界发现了两千多种抗菌肽，抗菌肽具有广谱抗菌性，可杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与真菌等。抗菌肽作为抗菌药物具有无毒副作用、无残留、无污染等优点，目前关于抗菌肽的制备和抗菌机理研究已广泛展开。抗菌肽的获取方法之一酶解法通过水解农副产品和水产品等废弃物获得抗菌肽，是大批量生产抗菌肽最有前途的方法之一，这种方法在制备抗菌肽中得到了广泛应用。

渔获物中的小鱼、小虾与水产品加工下脚料如内脏等称为低值鱼产品，低值鱼因技术原因多用来生产饲料甚至直接作为废物直接丢弃，大部分的低值鱼含有丰富的蛋白质，利用低值鱼酶解法生产抗菌肽具有很大的实际意义与经济价值。

关于酶解法制备抗菌肽的技术有很多方法，现有技术如授权公众号为

CN 103388014 B的中国发明专利，公开了一种亚铁螯合抗菌肽制备方法，该方法具有操作简单、成本低廉等特点，但其具有杂质残留、抗菌肽获取量少、纯度不高等缺点。

发明内容

本方法的目的在于提供一种低值鱼抗菌肽的加工方法。该方法具有取材环保，原料价格低廉，细菌、脂肪酸等杂质残留量少，成品获取率高，纯度高等优点。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种低值鱼抗菌肽的加工方法，包括：准备并除菌、脱脂、微波萃取提纯、离心提纯、酶解、离心纯化、硫酸铵纯化和成品，具体包括以下步骤：

准备并除菌：取新鲜的鱼鳔若干，剖开并除去血管及粘膜后用蒸馏水清洗3-5次，剪碎称量10-15g置于500ml可密闭不锈钢容器中，加入20-30g蒸馏水，在压强为50-80MPa，温度为90-100℃条件下蒸煮30-50分钟，其灭菌的基本原理就是高温高压对微生物的致死作用，主要是通过破坏细胞膜抑制酶的活性和影响DNA等遗传物质的复制来实现的；

脱脂：在除菌步骤后得到的鱼鳔浆液中加入0.010-0.015g的脂肪酶，在35-38℃条件下，搅拌并通风，使其反应20-30分钟，然后升温至90-100℃蒸煮5分钟使酶失活，降至常温，完成脂肪酶解和脂肪酸氧化，得到脱脂鱼鳔浆液，脂肪酶解和脂肪酸氧化能有效降低脂肪酸的代谢产物的含量；

微波萃取提纯：将脱脂步骤后的鱼鳔浆液注入1L烧杯中，称量浆液重量，用蒸馏水把不锈钢容器壁上的残留浆液冲洗至烧杯中，并往烧杯中加入蒸馏水，直至冲洗容器壁所用蒸馏水和直接加入烧杯中的蒸馏水总重量是鱼鳔浆液重量的25-30倍，搅拌均匀，将浆液进行微波萃取，萃取功率为300-400W，萃取时间为2-3分钟，微波萃取能将脱脂步骤中生成的杂物去除，有效的提高浆液中蛋白质的占比；

离心提纯：将微波萃取提纯步骤后的萃取液于4000-4500r/min条件下离心15-20分钟，取上清液，用蒸馏水润洗离心管和残渣再离心提取一次，合并上清液即为鱼鳔蛋白提取液，离心提纯进一步提纯鱼鳔蛋白质；

酶解：将离心提纯后的鱼鳔蛋白提取液注入500ml密闭不锈钢容器中，用清水润洗烧杯壁，润洗液也注入不锈钢容器中，用0.1ml盐酸调节其pH为5-7，再加入0.07-0.1g的复合蛋白酶，加入0.02-0.05g的酶活性肽，在50-60℃下反应2.5-3小时，后升温至90-100℃蒸煮5分钟使酶失活，后降至常温，酶活性肽能有效提高复合蛋白酶的水解活性，提高水解反应速率，将提取液中的蛋白质有效酶解为抗菌肽，该酶活性肽的氨基酸序列为：SCASRCKSRCRARRCRARFGKRCICKCFRC；

离心纯化：将酶解步骤后的酶解液置于离心机中，于35-38℃在4000-4500r/min条件下离心10-15分钟，取上清液，将上清液在4-6℃下冷冻离心，在转速7500-8000r/min条件下下离心10-15分钟，取上清液备用，有效提纯酶解液中抗菌肽的含量；

硫酸铵纯化：将研细的硫酸铵按照15-20%的饱和度加入到上述上清液中，4-6℃下保存过夜后在9500-10000r/min下离心30-45分钟，取上清液加硫酸铵至55-60%饱和度；4-6℃下保存过夜后用9500-10000r/min离心30-45分钟，取沉淀留用，本步骤先是有效去除了初步分离的杂蛋白，后沉淀所得即为纯化抗菌肽。

成品：将硫酸铵纯化后的沉淀在-60~-80℃冷藏保存，有助于保存运输。