[发明专利]基于量子点标记敌百虫仿生免疫吸附检测方法

说明书

本发明涉及一种基于量子点标记的敌百虫快速检测方法，以量子点标记半抗原作为标记物；是以亲水性分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，利用免疫吸附测定原理，建立对敌百虫具有广泛检测范围的快速灵敏检测方法。本发明将分子印迹技术与免疫技术联用建立对敌百虫具有高灵敏度的仿生免疫吸附检测方法，大大缩短了分析时间(比生物免疫分析缩短1.0h)，适用于快速检测敌百虫。本发明成本低廉，灵敏度高，实验操作简单，可广泛应用于各种食品中敌百虫的检测。

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是一种基于量子点标记敌百虫仿生免疫吸附检测方法。

背景技术

敌百虫(trichlorphon，O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)膦酸酯)是一种应用广泛地有机磷光谱杀虫剂，具有高效、低毒、低残留、水溶性好等特点，因此被广泛应用于农业生产。然而敌百虫在农药生产过程中的不合理施用，也带来了农药残留危害的问题，它对动物神经系统的损害以及致癌性和致突变性也越来越引起人们的重视。GB 16319-1996规定食品中敌百虫最大残留量不得高于0.1mg Kg^-1。

目前国内外有关食品中敌百虫检测方法大都采用气相色谱法、高效液相色谱法或液相、气相色谱与质谱联用的方法进行定性、定量的检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂贵，原材料消耗大，需要复杂样品前处理技术。而酶联免疫法虽然具有高灵敏度和低检出限，但是酶是大分子物质，以酶标记抗原影响抗体对其的吸附性，且生物抗体存在制备周期长，保存不当易失活等问题，影响其对敌百虫的检测。以量子点标记抗原，分子印迹聚合物作为仿生抗体，不但提高了方法的吸附性和灵敏度，而且印迹聚合物制备周期短，不存在失活问题，因此以量子点作为标记物，印迹聚合物作为仿生抗体，建立仿生免疫吸附检测技术，用于检测农产品及食品中的敌百虫，具有重要意义。本发明与现有免疫分析方面技术相比，创新点体现在用量子点代替酶建立仿生免疫分析，提高了仿生免疫分析的灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的敌百虫检测方法存在的灵敏度低、检测时间长、仪器价格昂贵、前处理烦琐等缺陷，提供了一种基于量子点标记敌百虫仿生免疫吸附检测方法。

本发明采取的技术方案是：

一种基于量子点标记敌百虫仿生免疫吸附检测方法，步骤如下：

1.量子点标记抗原的制备：将敌百虫半抗原、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和CdSe/ZnS氨基量子点按照200:4000:1～5的摩尔比例依次加入到反应容器中，充分混匀；加入50-100μL pH 7.4的硼酸盐缓冲液，避光室温反应2-10h。反应结束后，离心除团聚，将反应物超滤浓缩进行分离纯化得到量子点标记抗原，2-8℃下保存。

2.亲水性印迹聚合物膜的制备：将敌百虫，功能单体，交联剂按照1:2:2的摩尔比例混匀，96孔酶标板上每孔加入200μL反应液在氮气环境下聚合反应18h；用7:1(体积比v/v)甲醇-醋酸混合溶液超声8h除去敌百虫，再用浓度为100％甲醇清洗4h，37℃干燥2h后得到亲水性分子印迹聚合物膜。

3.以亲水性分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将所述量子点标记抗原用浓度为10％甲醇硼酸盐溶液稀释500倍作为量子点标记稀释液用于竞争反应，具体步骤如下：

将96孔酶标板第1行设为空白组，每孔只加200μL浓度10％甲醇硼酸盐溶液；第2行设为对照组，每孔加100μL量子点标记稀释液和100μL浓度10％甲醇硼酸盐溶液；第3-8行每孔均依次分别加入敌百虫标样梯度稀释液和100μL量子点标记物稀释液；室温竞争反应1h，多功能酶标仪读取荧光值，计算抑制率，绘制敌百虫标准曲线。

4.样品中加入浓度10％甲醇硼酸盐溶液中超声提取3次，定容后用0.45μm滤膜过滤得样品提取液。将样品提取液代替步骤3)中所述敌百虫标准溶液，重复步骤3)操作，计算出待测物中敌百虫含量。

本发明的优点和积极效果是：