[发明专利]细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法

说明书

本发明提供细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本发明还提供其可溶性表达方法，应用本发明的方法可实现Sigma‑GST的高水平表达，且表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%。本发明还提供使用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组Sigma‑GST的蛋白纯化方法，可制备大量高纯度的细粒棘球绦虫Sigma‑GST。将该纯化蛋白作为包被抗原，可制备得到一种用于检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒。

技术领域

本发明涉及一种细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法。

背景技术

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一种具有多种生理功能的酶，该酶在微生物、植物、昆虫、鸟类及哺乳动物细胞内广泛存在。在哺乳动物体内共发现8类细胞质(Alpha,Mu，Pi，Theta，Sigma，Zeta，Kappa，Omega)GSTs。GST在解毒内源和外源性有毒物质中起着重要作用，GST能催化内源还原性谷胱甘肽(GSH)与各种有害的亲电性底物相结合，增加有害物质的可溶性从而有利于其从细胞内排出，起到解毒的作用，进而保护生物体内的核酸和蛋白质免受亲电基团攻击。同时也参与胞内物质转运、激素的合成和细胞氧化应激损伤的保护。寄生蠕虫的GST被认为是对蠕虫感染化学治疗理想的药物靶标。基于以上研究背景，本发明构建了编码细粒棘球绦虫Sigma-GST基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为包虫病治疗药物的研究提供了有效的药物靶点，并有望用于囊型包虫病患者的免疫诊断。

发明内容

本发明通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫Sigma-GST原核表达载体pET30a-Sigma-GST，利用该载体转化大肠杆菌(BL21-DE3)实现了Sigma-GST的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量高纯度的新的细粒棘球绦虫Sigma-GST，用于GST生化特性分析、功能的研究及抗包虫药物的研发及囊型包虫病患者的免疫诊断。

本发明的第一个目的是提供细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

作为优选，所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1中第63位-701位碱基。

本发明的第二个目的是提供上述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：

(1)目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶的扩增；

(2)构建Sigma-GST表达质粒：将步骤(1)制备的目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶纯化后酶切，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-Sigma-GST；

(3)将步骤(2)制备的质粒pET30a-Sigma-GST转化入E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入0.2mmol/L的IPTG于20℃诱导振荡培养7小时，离心、超声后收集上清。

本发明的第三个目的是提供上述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤如下：

(1)清洗HisTALON^TM Gravity Columns预装柱；

(2)加入结合缓冲液，所述结合缓冲液为：50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；