[发明专利]一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法

说明书

本发明公开了一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法，包括：大豆预处理、培养基制备、种子制备、接种、变温发酵、干燥、粉碎等单元操作。该方法是集原料预处理、培养基与种子制备、接种、发酵、干燥和粉碎等技术为一体，整个过程是在洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏等不良现象，易于达到GMP要求。与传统法相比，本发明具有如下特点：巧妙的原料预处理和多组分培养基的组方设计，为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；变温发酵方法及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高10‑45%；方法科学，工艺合理先进，利于环保。本发明可广泛用于纳豆激酶及其它相关产品的研发和生产。

技术领域

本发明属生物工程与技术领域，具体涉及一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法。

背景技术

纳豆是日本人最爱吃的传统大豆发酵食品，纳豆激酶（Nattokinase，NK）是用大豆发酵制备的一种具有多种生物活性的蛋白酶，人们已对其进行了相当广泛深入的研究。现代科学研究已表明，它的结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，其溶栓作用优于蛇毒纤溶酶、尿激酶（UK）和蚓激酶，具有4倍大于纤溶酶的纤溶活性，分子量远远小于尿激酶、蚓激酶，且可由肠道吸收。据报道，纳豆激酶可以有效地溶解血栓，另外还具有降低血液粘度，抑制血小板凝固，降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能。纳豆激酶不仅拥有纤溶酶原激活活性，而且还能直接消化利用有限的蛋白质纤维。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定，在体内作用迅速，持续时间长，还能激活体内的纤维蛋白酶，使之温和、持续地提高血液的溶纤活性。其溶解血栓作用上的优点是它的持续性。目前临床上常用的血栓溶解剂（溶栓药物）大都是注射剂，无论是哪种注入体内，其作用时间(半衰期)都很短，只有4～20分钟，而纳豆激酶的作用时间可长达4～8小时。所以，纳豆激酶不仅有望成为临床治疗血栓病的首选治疗剂，其不同级别不同类型的制剂在预防和保健领域也将发挥重要作用。

虽然人们已对纳豆激酶的理化特性和生理药理活性进行了相当多的研究，但在如何高效制备纳豆激酶的方法学方面的研发工作开展较少。经典的生产纳豆与纳豆激酶所用的方法是仅仅以大豆为原料，经过浸泡、蒸煮、降温后接种发酵即可，但大豆内部菌体不易生长，产率自然不会太高；CN102586141B公开了一种以黄豆蒸煮水为主原料辅之以2种无机盐的作为培养基的液态发酵法，这种情况原料的利用率难免太低；CN103205409B公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法；CN106085991A公开了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，它提供了一种以花生粕为主要原料制备纳豆激酶的方法；上述专利虽为生产纳豆激酶提供了多种原料选择并对产酶量的提升做出了一定贡献，但普遍存在原料预处理不充分，所用培养基营养组分不太均衡或不足，原料利用率偏低，发酵工艺优化不足或有待改进，微生物生长不甚旺盛，难以充分发挥纳豆菌的产酶特性，产酶效率不高等问题。

发明内容

为解决上述技术方法的不足或缺陷，本发明提供一种固态发酵法制备纳豆激酶的新方法。包括以下工艺步骤：⑴预处理大豆的制备；⑵发酵及种子培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)干燥；(7)粉碎；

具体方法步骤为：

⑴预处理大豆的制备

预处理大豆的制备是指在定时消毒的洁净环境中按照如下工艺步骤进行：

a.称量

根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；

b.雾水润豆

将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；

c.适度破碎

将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6-10片或米粒大小即可；

d.加水浸泡